表達(dá)Aβ3-10s以缺陷腺病毒為載體的基因疫苗鼻粘膜免疫AD雙轉(zhuǎn)基因鼠對老年斑形成的預(yù)防作用及對免疫反應(yīng)的影響.pdf

1、前言及目的：
　　 阿爾茨海默病(AD)是癡呆中最常見的類型,在AD的多種病理改變中,Aβ縮氨酸成為了重要的治療目標(biāo)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),β-淀粉樣蛋白(Aβ)在AD病情進(jìn)展中扮演了重要的角色?；蚣夹g(shù)的發(fā)展為AD的基因治療提供了理論基礎(chǔ),使免疫治療AD成為了可能。在AD的主動免疫和被動免疫的基礎(chǔ)研究中,免疫治療可以減少腦內(nèi)老年斑的沉積,改善認(rèn)知能力的下降。1999年AN1792疫苗(由人工合成的Aβ1-42和有表面活性的QS-2

2、1為佐劑組成)在臨床實驗中取得了一定的效果,雖然Ⅱ期臨床實驗中出現(xiàn)了無菌性腦膜炎被迫停止,但是經(jīng)AN1792免疫過的AD患者在以后多年的觀察中未再發(fā)現(xiàn)腦膜炎癥狀,幾例尸檢發(fā)現(xiàn)患者腦內(nèi)老年斑減少,其他患者在認(rèn)知能力方面有一定的改善。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)在Aβ免疫中起到了主要的作用,膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多,第二代AD疫苗的研究重點在盡量避免細(xì)胞免疫,加強(qiáng)體液免疫。研究認(rèn)為,Aβ1-42的C末端有數(shù)個抗原決定簇,可以激活與炎癥有關(guān)的

3、T細(xì)胞反應(yīng),N末端含B細(xì)胞抗原決定簇,不誘發(fā)炎癥反應(yīng)。與疫苗相連的佐劑及載體的選擇也成為了人們研究的重點。研究構(gòu)建一個具有安全性和有效性的Aβ疫苗可以減少老年斑、改善行為學(xué),同時避免疫苗的副作用,增強(qiáng)Th2型免疫反應(yīng),抑制Th1型免疫反應(yīng),為進(jìn)一步的臨床治療提供基礎(chǔ),從而減輕AD患者的痛苦。
　　 實驗材料和方法：
　　 基于以上的理論基礎(chǔ),我們將人工合成的Aβ3-10的基因片段插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+,以C

4、pG為基因佐劑,使用E1/E3缺陷的腺病毒載體pAxCAwtit作為基因載體,將目的基因Aβ3-10CpG插入此腺病毒載體,再將腺病毒載體包裝入真核細(xì)胞,獲得基因重組缺陷腺病毒AdCpG-(Aβ3-10)10。通過鼻粘膜免疫雙轉(zhuǎn)基因小鼠B6.Cg-Tg(APPswe,PSEN1dE9)。選擇Aβ肽鏈N端的氨基酸序列3-10避免了C端T細(xì)胞抗原決定簇的細(xì)胞免疫反應(yīng),佐劑CpG可以誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng),缺陷的腺病毒載體可以用于粘膜免疫,從而

5、減少肌肉注射帶來的痛苦。我們將實驗設(shè)為三組,含有目的基因的hdCpG-(Aβ3-10)10、不含目的基因的AdCpG組、Aβ1-42全肽鏈組分別免疫雙轉(zhuǎn)基因小鼠,每三周免疫一次,免疫八次,免疫期間采血四次用ELISA方法檢測血清IgG抗體,免疫完成后進(jìn)行Morris水迷宮實驗測試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,潛伏期時間和空間探索試驗即平臺所在象限時間與總時間比值,然后用免疫組化方法觀察腦內(nèi)老年斑的數(shù)量測定OD值,星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化,HE染色觀察各個

6、臟器有無病理改變,同時用MTT。方法觀察脾細(xì)胞增值反應(yīng),Con A刺激和各自抗原刺激結(jié)果,刺激后用ELISA法檢測IL-2、IL-4、IL-10及γ-干擾素等細(xì)胞因子含量,了解炎性反應(yīng)類型。
　　 結(jié)果：
　　 雙轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)六個月AdCpG-(Aβ3-10)10疫苗免疫,進(jìn)行血清抗體檢測,免疫第四次后各組可以檢測到抗Aβ42抗體,第六次免疫后hdCpG-(Aβ3-10)10組和Aβ-42組小鼠檢測到高濃度的抗Aβ42抗

7、體,AdCpG-(Aβ3-10)10組和Aβ1-42組小鼠血清中檢測出抗體濃度較上一次增高(AdCpG-(Aβ3-10)1021.17±1.59ng/ml,Aβ1-4223.93±1.66 ng/ml),與對照組比較有明顯差異(P＜0.05),免疫8次后AdCpG-(Aβ3-10)10組和Aβ1-42組小鼠血清中檢測出抗體濃度與上一次相近,(AdCpG-(Aβ3-10)1018.95±0.74ng/ml,Aβ1-4221.57±1.31

8、ng/ml),與對照組比較有明顯差異(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)法顯示腦內(nèi)海馬區(qū)及腦皮質(zhì)沉積的Aβ老年斑,AdCpG-(Aβ3-10)10組和Aβ1-42組小鼠的腦內(nèi)各區(qū)老年斑減少,Aβ3-10組老年斑的面積占海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)總面積的比例是2.58‰;Aβ1-42組老年斑的面積占海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)總面積的比例是3.29‰;對照組老年斑的面積占海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)總面積的比例是39.37‰。因此AdCpG-(Aβ3-10)10組和Aβ1-42免疫的

9、小鼠Aβ的沉積比對照組明顯減少(P＜0.01),AdCpG-(Aβ3-10)10組和Aβ1-42免疫的小鼠之間Aβ的沉積無明顯差異(P＞0.05)。HE染色各組小鼠臟器結(jié)構(gòu)正常。十個月時進(jìn)行Morris水迷宮實驗,AdCpG-(Aβ3-10)。。組和Aβ1-42組小鼠逃避潛伏期時間較對照組明顯縮短(P＜0.05),空間探索實驗AdCpG-(Aβ3-10)。。組和Aβ1-42組小鼠在平臺所在象限時間較對照組明顯增多(P＜0.05),說明A

10、dCpG-(Aβ3-10)10組和Aβ1-42組小鼠免疫后認(rèn)知能力得到改善,AdCpG-(Aβ3-10)10組和Aβ1-42組小鼠的潛伏期隨著訓(xùn)練時間的增加而逐步減少(P＜0.05),與對照組AdCpG小鼠的潛伏期比較有明顯差異(P＜0.05);AdCpG-(Aβ3-10)。。和Aβ1-42組小鼠在撤掉平臺后尋找平臺過程中穿越平臺所在象限的時間占總時間比值(Aβ3-10組10.87±3.27;Aβ1-42組12.45±4.12)較對照組

11、(7.32±4.98)明顯增多(P＜0.05)。AdCpG-(Aβ3-10)10疫苗和Aβ1-42免疫后,脾細(xì)胞體外培養(yǎng),經(jīng)Con A刺激脾細(xì)胞增殖數(shù)量增多,與對照組比較有明顯差異(P＜0.05),各自抗原刺激后經(jīng)AdCpG-(Aβ3-10)10疫苗免疫的脾細(xì)胞體外培養(yǎng),培養(yǎng)液中IL-4(342.34±45.68)和IL-10(329.46±112.99)較高,經(jīng)Aβ42免疫后的脾細(xì)胞增殖分泌的細(xì)胞因子IL-2(284.81±22.55

12、),INF-γ(361.96±26.47),IL-4(223.19±22.45)和IL-10(258.68±102.42)均較高,與對照組比較結(jié)果有明顯差異(P＜0.05)。AdCpG-(Aβ3-10)10組小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞,Aβ1-42組腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯,星形膠質(zhì)細(xì)胞在海馬區(qū)細(xì)胞量明顯增多,突起明顯增多,呈分枝狀。
　　 結(jié)論：
　　 我們的研究顯示用AdCpG-(Aβ3-10)10疫苗主動免疫三個月的雙轉(zhuǎn)

13、基因鼠B6.Cg-Tg(APPswe,PSEN1dE9),誘導(dǎo)出了高濃度的抗Aβ42血清抗體,抑制了腦內(nèi)老年斑的生成,改善了轉(zhuǎn)基因鼠的認(rèn)知功能,證明了疫苗的有效性;對免疫后轉(zhuǎn)基因鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測,AdCpG-(Aβ3-10)10疫苗免疫后的IL-4和IL-10水平明顯增高,IL-2和INF-γ含量低;此外腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化受到抑制,結(jié)果說明疫苗主要產(chǎn)生了Th2型體液免疫應(yīng)答,沒有明顯的Th1型細(xì)胞