新生血管生成抑制劑內(nèi)皮抑素的化學修飾及修飾物的生物活性和藥代動力學研究.pdf

1、內(nèi)皮抑素（ES）是一種內(nèi)源性的新生血管生成抑制因子，能夠有效地抑制新生血管的形成，從而切斷腫瘤的營養(yǎng)供給途徑和廢物代謝途徑，起到抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的作用。基于這樣一種原理，ES作為一種抗腫瘤藥物，與化療藥物相比具有極低的毒副作用、廣譜抑瘤作用，并且在長期反復治療中不會引起耐藥性。目前，ES在國內(nèi)已經(jīng)作為一種用于治療非小細胞性肺癌的藥物應用于臨床。然而，目前仍然有一些較大的障礙大大地限制了其臨床應用。ES應用于人體的有效劑量是300 m

2、g/㎡·d，如此大的劑量不但易對人體產(chǎn)生意想不到的副作用，而且也導致患者費用用藥高，這是限制ES臨床應用的最大障礙。另外，ES穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短也使其保存條件比較苛刻、用藥次數(shù)較為頻繁。如果能夠通過一定的手段提高其穩(wěn)定性、延長其體內(nèi)半衰期、提高其體內(nèi)活性從而減少給藥劑量或延長給藥周期，將會大大提高ES的治療效果，促進其在臨床上的應用。本課題運用了化學修飾的方法采用三種不同的化學修飾劑[聚乙二醇（PEG）、低分子肝素（LMWH）和多硫

3、酸化肝素（PSH）]對ES進行結(jié)構修飾，并研究探討了修飾后ES的二級結(jié)構改變、穩(wěn)定性變化、生物活性變化、結(jié)構變化及其與活性的關系以及小鼠體內(nèi)的藥代動力學和組織分布，以期獲得一種較為理想的ES修飾物，并探討不同結(jié)構的修飾劑對ES性質(zhì)的影響。本課題的研究內(nèi)容及取得的主要成果有以下幾個方面。 1.內(nèi)皮抑素的分離純化及三種修飾劑對其化學修飾及修飾后熱穩(wěn)定性研究 含ES基因的畢赤酵母菌表達上清液經(jīng)纖維素CMⅡ離子交換層析柱和Sup

4、erdex75凝膠過濾層析柱分離純化得到電泳單點純的ES，并通過MTT比色法驗證了其抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）增殖的活性。 采用氰尿酰氯法活化PEG，活化后的PEG在pH9.0、10 mmol/L的四硼酸鈉緩沖液中對ES進行化學修飾；采用高碘酸鈉氧化法活化LMWH，活化后的LMWH于pH9.5、0.3 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖液中對ES進行化學修飾；采用高碘酸鈉氧化法活化PSH，活化后的PSH于pH9.

5、5、0.3 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖液中對ES進行化學修飾。通過SDS-PAGE監(jiān)測修飾反應過程，比較不同時間點修飾液中ES的自由氨基修飾率、活性保留百分率以及電泳監(jiān)測結(jié)果，確定三種修飾劑對ES的化學修飾結(jié)果均為一分子ES可與三分子的修飾劑相結(jié)合，PEG、LMWH和PSH修飾ES較理想的修飾反應時間分別為為24 h、48 h和48 h。將修飾反應液經(jīng)預處理后，使用Superdex75凝膠過濾層析柱進行分離純化，獲得了E

6、S的修飾物PEG-ES，LMWH-ES和PSH-ES。本研究考察了ES及其修飾物在25℃和37℃水浴中的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)修飾后的ES較未修飾的熱穩(wěn)定性有明顯提高。25℃時，其穩(wěn)定性為PEG-ES，PSH-ES>LMWH-ES>ES；37℃時，其穩(wěn)定性PEG-ES>PSH-ES，LMWH-ES>ES。 2.內(nèi)皮抑素及其修飾物的二級結(jié)構分析 采用圓二色譜法（CD）對ES及其修飾物的二級結(jié)構進行研究，并比較其差別。結(jié)果顯示PEG

7、-ES中β-轉(zhuǎn)角成分變化較大，由原來的16.20％變化為23.21％，其他成分變化較小，與前期利用傅立葉變換紅外光譜分析所得結(jié)果一致；LMWH-ES中ES二級結(jié)構各成分較未修飾的ES變化均較小，也與前期利用傅立葉變換紅外光譜分析所得結(jié)果一致；PSH-ES中β-反平行變化較大，由1.17％變化為3.52％，但由于β-反平行在ES二級結(jié)構構象中所占總體比例非常小，PSH-ES的二級結(jié)構較未修飾的ES變化也不大?？傮w而言，除PEG-ES的β-

8、轉(zhuǎn)角成分外，三種修飾產(chǎn)物的二級結(jié)構與ES比較無較大變化。 3.內(nèi)皮抑素及其修飾物對內(nèi)皮細胞親和性研究 3.1流式細胞術研究內(nèi)皮抑素及其修飾物對內(nèi)皮細胞親和性 借助流式細胞檢測考察了ES及其三種結(jié)合物對內(nèi)皮細胞的結(jié)合能力。FITC標記的ES、PEG-ES、LMWH-ES以及PSH-ES與內(nèi)皮細胞共同孵育，研究表明，PSH-ES對細胞的結(jié)合能力最強，其次是LMWH-ES和PEG-ES，陽性率分別為57.15％、54.

9、08％和48.01％，而ES孵育組陽性率只有18.47％。 3.2激光共聚焦顯微鏡技術研究ES及其修飾物內(nèi)皮細胞內(nèi)分布 FITC標記的ES及ES衍生物與內(nèi)皮細胞共孵育1h后，ES組的熒光信號較弱，而PEG-ES組、LMWH-ES組和PSH-ES組的熒光信號與ES相比有不同程度的增強，且LMWH-ES和PSH-ES組熒光略強于PEG-ES組。FITC標記的ES及ES衍生物與內(nèi)皮細胞共孵育2h后，熒光強度均比1h時的相同藥

10、物組有不同程度的增強，且三個修飾物組均表現(xiàn)出比ES組更強的熒光強度。 4.內(nèi)皮抑素及其修飾物抑制血管生成及抗腫瘤作用研究 將純化后的ES及其修飾物作用于雞胚絨毛尿囊膜（CAM）血管，以蒸餾水作為空白對照，堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）作為陰性對照，觀察了ES及其修飾物對bFGF誘導的CAM血管生成的抑制作用。結(jié)果表明，純化后的ES能夠明顯抑制bFGF誘導的CAM血管的生成，與bFGF組比較，CAM血管數(shù)由（25.2±

11、3.55）減少為（11.3±1.24）（ES濃度為0.5μg/embryo）。隨著ES濃度的增大，抑制作用增強，血管分支數(shù)目減少，血管密度降低。PEG，LMWH和PSH修飾的ES也能夠明顯地抑制bFGF誘導的CAM血管的生成，血管數(shù)分別減少為（11.8±1.38）、（10.8±2.14）和（8.6±0.53），除PEG-ES外其抑制活性均高于較未修飾的ES。 利用激光燒傷法造成脈絡膜新生血管（CNV）模型，然后將純化后的ES及其

12、修飾物玻璃體腔注射給藥，分別于給藥3天及7天后觀察ES及其修飾物對脈絡膜新生血管的抑制作用，并利用Western blotting檢測了堿燒傷治療后其血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及色素上皮衍生因子（PEDF）的表達。用藥3天后，CNV的面積分別為：PBS組18.14×103μ㎡，ES組10.65×103μ㎡，PEG-ES組8.92×103μ㎡，LMWH-ES組9.02×103μ㎡，PSH-ES組8.97×103μ㎡，與ES相比較三種修飾

13、產(chǎn)物其P值均小于0.05，顯示ES及其修飾物組CNV的面積明顯小于PBS組，且三種修飾物組CNV面積均小于ES組；用藥7天后，CNV的面積分別為：PBS組23.28×103μ㎡，ES組14.20×103μ㎡，PEG-ES組11.93×103μ㎡，LMWH-ES組12.74×103μ㎡，PSH-ES組12.15×103μ㎡，顯示ES及其修飾物組CNV的面積明顯小于PBS組，且三種修飾物組CNV面積均小于ES組，其P值均小于0.05。Wes

14、tern blotting結(jié)果表明，ES及其修飾物還能夠明顯地下調(diào)脈絡膜VEGF的表達、上調(diào)PEDF的表達。 ES及其修飾物能明顯抑制斑馬魚模型體節(jié)間血管生成，與對照組相比具有顯著性差異，其P值均小于0.05。在濃度分別為5μg/mL、10μg/mL和50μg/mL時，ES及其各修飾組對體節(jié)間血管的抑制率分別為：ES組13.21％、22.22％、41.74％， PEG-ES組18.62％、34，23％、49.25％， LMWH

15、-ES組18.92％、31.53％、46.85％，PSH-ES組19.22％、39.64％、55.25％。三種修飾產(chǎn)物與ES相比，均具有更好的抑制活性。 ES及其修飾物對荷S180腫瘤小鼠腫瘤的抑制作用實驗顯示，ES、PEG-ES、LMWH-ES、PSH-ES四組抑瘤率分別為40.50％、51.24％、61.98％和65.29％，三種修飾產(chǎn)物其體內(nèi)抑制腫瘤活性均高于ES本身。 5.內(nèi)皮抑素及其修飾物藥代動力學及組織分布

16、研究 利用125I放射性標記技術標記ES及其衍生物，并研究了其在小鼠體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)和組織分布情況。 結(jié)果表明，三種修飾后的蛋白PEG-ES、LMWH-ES和PSH-ES的消除半衰期分別為43.88 h、39.54 h和35.58 h，均明顯長于原始ES蛋白的8.81 h，他們的分布半衰期也均長于ES本身，另外，修飾后的蛋白其血漿清除率明顯低于ES，曲線下面積和一階曲線下面積均高于ES，血漿保留時間也獲得延長，說明三

17、個修飾劑對ES的化學修飾均實現(xiàn)了延長其半衰期的效果。PSH-ES靜脈注射后在肝組織具有較高的蓄積性，其他兩種修飾產(chǎn)物與ES相比較組織分布情況差別不大。 本研究取得的成果和結(jié)論主要有： （1）采用PEG、LMWH和PSH對ES進行化學修飾，實現(xiàn)了對PEG-ES、LMWH-ES和PSH-ES的分離純化，獲得了穩(wěn)定性較好的ES修飾物。 （2）運用CD技術對PEG-ES、LMWH-ES和PSH-ES的二級結(jié)構進行分析，發(fā)現(xiàn)P

18、EG對ES的化學修飾對β-轉(zhuǎn)角成分影響較大，LMWH和PSH修飾對其二級結(jié)構各成分影響不大。 （3）運用流式細胞技術和激光共聚焦顯微鏡技術發(fā)現(xiàn)三種修飾劑修飾之后的ES與天然ES相比對內(nèi)皮細胞的親和性更強。 （4）ES及其修飾物能夠明顯抑制HUVEC的增殖、CAM血管、斑馬魚體節(jié)間血管和激光致脈絡膜血管的生長、荷瘤小鼠腫瘤的生長，且修飾物的效果更好。 （5）ES的三種修飾產(chǎn)物體內(nèi)半衰期均明顯長于ES本身，其體內(nèi)組織分布較