腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子前體ProBDNF在大鼠后足切割痛的作用及可能機(jī)制研究.pdf

1、第一章背根神經(jīng)節(jié)proBDNF在大鼠后足切割后的表達(dá)及作用
　　 目的:觀(guān)察大鼠后足切割后proBDNF表達(dá)變化及對(duì)切割疼痛的影響。
　　 方法:采用縱行切割SD大鼠后足作為疼痛模型，運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)記方法，觀(guān)察大鼠后足切割后不同時(shí)間點(diǎn)（1-72 hr）proBDNF在相應(yīng)節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)的表達(dá)變化。腹腔注射proBDNF抗體中和內(nèi)源性proBDNF后，以Von Frey尼龍纖維刺激后足行機(jī)械痛敏評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果

2、:大鼠后足切割后1-24 hr內(nèi)，proBDNF在切割同側(cè)背根神經(jīng)節(jié)表達(dá)上調(diào)，proBNDF免疫陽(yáng)性細(xì)胞百分比在切割后1-24 hr內(nèi)也明顯增加。腹腔內(nèi)給予proBDNF抗體明顯增加大鼠后足切割后的縮足閾值。
　　 結(jié)論:大鼠后足切割后背根神經(jīng)節(jié)proBDNF表達(dá)上調(diào)，proBDNF參與了大鼠后足切割后機(jī)械痛敏的過(guò)程。
　　 第二章 proBDNF腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　 目的:構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的proBDNF

3、基因用于活體組織的研究。
　　 方法:從提供的模板中利用PCR方法釣取目的基因，而后將目的載體進(jìn)行酶切，產(chǎn)物電泳回收后進(jìn)行交換，再把交換產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。然后對(duì)長(zhǎng)出的克隆先進(jìn)行菌落PCR鑒定，再進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析。測(cè)序正確后，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24小時(shí)后，用熒光顯微鏡觀(guān)察綠色熒光蛋白的表達(dá)變化。從菌落中收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的目的細(xì)胞，提取蛋白，采用Western Blot的方法檢測(cè)目的基因

4、的表達(dá)情況。采用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)包括腺病毒穿梭質(zhì)粒和輔助包裝質(zhì)粒(pBHG lox△E1，3 Cre)共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，再對(duì)pDC315-proBDNF病毒擴(kuò)增、提純和Western Blot檢測(cè)。
　　 結(jié)果:所構(gòu)建的pDC315-proBDNF重組腺病毒經(jīng)酶切、PCR和Western Blot鑒定成功的轉(zhuǎn)化了proBDNF，基因片段大小為741bp。原代病毒滴度為8.0×109 PFU/mL，proBDNF在