神經(jīng)元EphA4介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrin-A3逆向通路激活對(duì)缺血后海馬損傷的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞間通訊在缺血后神經(jīng)血管單元的損傷和功能重建中所發(fā)揮的重要作用越來(lái)越受到重視。分別表達(dá)于神經(jīng)元的EphA4和表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的ephrin-A3在既往的研究中被認(rèn)為可以通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrin-A3逆向通路調(diào)節(jié)細(xì)胞外谷氨酸濃度進(jìn)而影響樹(shù)突棘的形態(tài)和功能，此外，另有研究發(fā)現(xiàn)EphA4/ephrin-A3在缺血后的海馬組織出現(xiàn)顯著地表達(dá)上調(diào)，提示其參與海馬缺血后的病理生理過(guò)程。本研究旨在使用預(yù)聚集化

2、的EphA4激活ephrin-A3通路，觀察ephrin-A3逆向通路在海馬缺血后的病理生理過(guò)程中所扮演的角色及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　使用Pulsinelli四血管阻斷法建立全腦缺血再灌注模型，采用半定量RT-PCR觀察假手術(shù)組及缺血組在缺血后不同時(shí)間點(diǎn)EphA受體酪氨酸蛋白激酶及其配體ephrin-A mRNA變化的情況。免疫熒光雙標(biāo)法觀察EphA4/ephrin-A3在海馬的定位。Western Blot法檢測(cè)Ep

3、hA4/epnrin-A3缺血后的表達(dá)改變。免疫共沉淀證實(shí)EphA4/epnrin-A3受體配體復(fù)合物形成。Nissle染色和TUNEL染色檢測(cè)預(yù)聚集化的EphA4激動(dòng)ephrin-A3逆向通路后海馬神經(jīng)元壞死和凋亡情況。Morris水迷宮檢測(cè)海馬依賴性空間記憶。Western Blot法及谷氨酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ephrin-A3逆向通路激活后星形膠質(zhì)細(xì)胞高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT1和GLAST表達(dá)變化及星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力。

4、>　　結(jié)果：
　　半定量PCR結(jié)果表明，EphA1-A8及EphA10 RNA在正常的海馬組織均有表達(dá)，而EphA4,EphA5是正常海馬含量較為為豐富的EphA受體，表達(dá)量緊隨其后的是EphA1、EphA7及EphA8，而EphA2、EphA3、EphA6及EphA10則在正常海馬表達(dá)相對(duì)較低。而在缺血再灌注后，EphA1-A8及EphA10的RNA表達(dá)呈現(xiàn)出不同變化模式，其中EphA1、EphA2、EphA3、EphA6、Ep

5、hA7及EphA8的RNA表達(dá)在缺血再灌注后的6小時(shí)即開(kāi)始出現(xiàn)上調(diào)，1天或3天表達(dá)到達(dá)頂峰后逐漸下降；而與此不同的是EphA4、EphA5和EphA10的表達(dá)自缺血再灌注后6小時(shí)開(kāi)始直至第7天其mRNA水平始終保持上升趨勢(shì)。ephrinA1-A5在正常的海馬組織均有表達(dá)，ephrin-A3是正常海馬含量最為豐富的ephrin-A配體，其次是ephrin-A1和ephrin-A2，而ephrin-A5和ephrin-A4則表達(dá)相對(duì)較少。而

6、在缺血后，ephrinA1-A5均出現(xiàn)了短暫地表達(dá)上調(diào)，其中以ephrin-A3最為顯著，并且在缺血再灌注后的第一天RNA表達(dá)量達(dá)到頂峰，ephrin-A1，ephrin-A2，ephrin-A4，ephrin-A5也出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)上調(diào)。免疫熒光雙標(biāo)顯示EphA4主要分布于NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元，而ephrin-A3主要定位于GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。Western Blot法顯示EphA4和epnrin-A3均出現(xiàn)缺血誘導(dǎo)性表達(dá)上調(diào)

7、，并都于缺血后1天表達(dá)到達(dá)峰值。此外，免疫共沉淀顯示EphA4及其高親和力配體間的相互作用隨著缺血誘導(dǎo)而增強(qiáng)。Nissle染色、TUNEL染色及Morris水迷宮檢測(cè)顯示缺血前30min側(cè)腦室注入預(yù)聚集化的EphA4激動(dòng)ephrin-A3逆向通路，加重了缺血后的海馬神經(jīng)元損傷并損害海馬依賴性空間記憶。Western Blot法及谷氨酸濃度測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)ephrin-A3逆向通路激動(dòng)下調(diào)了星形膠質(zhì)細(xì)胞高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT1和GLAS

8、T并明顯抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸攝取能力。
　　結(jié)論：
　　EphA4/epnrin-A3作為海馬區(qū)表達(dá)最為豐富的EphA受體和ephrin-A配體分別主要表達(dá)于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。在全腦缺血后EphA4/epnrin-A3均出現(xiàn)缺血誘導(dǎo)的一過(guò)性表達(dá)上調(diào)。預(yù)聚集化的EphA4激動(dòng)星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrin-A3逆向通路,導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT1和GLAST表達(dá)下調(diào)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸攝取能力，加重全腦缺血