亞硝酸降解與PMP衍生LC-MS聯(lián)用技術(shù)在糖胺聚糖結(jié)構(gòu)解析以及相關(guān)藥物質(zhì)量控制中的應(yīng)用研究.pdf

1、糖胺聚糖是一大類由糖胺或含糖胺的二糖作為基本重復(fù)單元組成的線性多糖，包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、甲殼素及甲殼胺等。肝素及硫酸乙酰肝素由不同程度及位點(diǎn)的O-磺酸、N-乙酰/磺酸修飾的氨基葡萄糖和糖醛酸二糖組成。硫酸軟骨素及硫酸皮膚素則由O-磺酸修飾的N-乙酰氨基半乳糖和糖醛酸組成。透明質(zhì)酸的二糖重復(fù)單元是沒有磺酸修飾的N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸。硫酸角質(zhì)素不含糖醛酸，主要由磺酸修飾的半乳糖和氨

2、基葡萄糖二糖組成。年產(chǎn)量達(dá)億噸的甲殼素是由N-乙酰氨基葡萄糖組成的多聚糖，其脫乙酰產(chǎn)物甲殼胺因?yàn)榫哂辛己玫睦砘再|(zhì)而倍受關(guān)注。
　　從動(dòng)物組織提取的肝素是臨床上已使用了近80年的的抗凝血藥物，也是世界上產(chǎn)量和銷售額最大的糖類藥物。近年來肝素類藥物的銷售量以每年20％的速度遞增，2009年全球肝素類藥物的銷售額已達(dá)69億美金。從動(dòng)物組織或軟骨提取的硫酸軟骨素廣泛被關(guān)節(jié)炎病人服用。在美國(guó)的非處方藥物中，硫酸軟骨素的銷售額位居第二。中國(guó)

3、也是硫酸軟骨素的主要出口大國(guó)，但除了硫酸軟骨素A作為藥用外，其它結(jié)構(gòu)硫酸軟骨素仍沒有進(jìn)入藥典。透明質(zhì)酸不僅因其保濕性用于美容，還具有很好的組織相容性而在眼科顯微手術(shù)、藥物釋放及組織工程領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。近20年研究發(fā)現(xiàn)，甲殼胺以及甲殼胺衍生物具有一些如抗菌，免疫刺激，降血脂，甚至有抗癌作用，目前在世界范圍內(nèi)有37項(xiàng)甲殼胺作為藥物的臨床研究。
　　糖胺聚糖類藥物和其它藥物的不同在于其靶點(diǎn)大多存在于細(xì)胞之外，不僅參與血液循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)

4、及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，而且參與細(xì)胞的粘附、識(shí)別以及信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等，其安全性高、毒性低以及特異性強(qiáng)的特性使其成為本世紀(jì)藥物開發(fā)的熱點(diǎn)。然而，由生物合成的糖胺聚糖結(jié)構(gòu)、分子量及磺化度多變難控，作為藥物其質(zhì)量控制是一個(gè)長(zhǎng)期解決不了的問題，因此嚴(yán)重阻礙了糖胺聚糖類藥物的研究與開發(fā)。
　　表征動(dòng)物來源糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的主要手段是酶降解產(chǎn)生二糖，然后使用各種分析手段對(duì)酶降解產(chǎn)生的二糖進(jìn)行與二糖標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比分析。這些方法的科學(xué)性建立在裂解酶可以完全將糖胺聚

5、糖降解為二糖，不存在不能被酶降解的片段。但是生物酶產(chǎn)品質(zhì)量控制，保存不當(dāng)都會(huì)導(dǎo)致活性差異，進(jìn)而無法保證糖鏈被全部降解成為可供分析的二糖，每次操作的差異性不可避免。更重要的是糖胺聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，幾乎所有糖胺聚糖都存在不能被酶降解成為二糖的片段。
　　本論文針對(duì)所有糖胺聚糖都含有氨基糖為基本出發(fā)點(diǎn)，開發(fā)了一種可以用于結(jié)構(gòu)解析和質(zhì)量控制的糖胺聚糖化學(xué)降解分析方法，這樣就可以擺脫酶解分析二糖中的一系列不可控因素。我們經(jīng)過實(shí)驗(yàn)選擇使用亞硝酸降

6、解動(dòng)物糖胺聚糖和甲殼胺。亞硝酸可以通過和糖鏈中的氨基糖，形成重氮鹽，重氮鹽的在水溶液環(huán)境不穩(wěn)定，容易形成穩(wěn)定程度更高的N2離去，重氮鹽碳原子缺電子受到糖環(huán)上C5位成環(huán)的O攻擊，可以形成新的五元糖環(huán)，隨之的是電子轉(zhuǎn)移到糖環(huán)的C1，導(dǎo)致糖苷鍵斷裂并形成新還原糖。亞硝酸降解產(chǎn)物可以和常用于糖類衍生的試劑1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)以1:2的比例反應(yīng)脫水形成具有強(qiáng)紫外吸收的糖-2PMP復(fù)合物，該復(fù)合物具有利于分離和檢測(cè)的特征，后續(xù)

7、可以使用高效液相分離檢測(cè)不同的糖-2PMP衍生物。糖胺聚糖可含葡萄糖胺(GlcN)或半乳糖胺(GalN，亞硝酸降解的產(chǎn)物分別是2，5脫水甘露糖(M)和2，5-脫水塔羅糖(T)。我們以葡萄糖胺的亞硝酸降解產(chǎn)物2，5脫水甘露糖為研究對(duì)象，優(yōu)化了亞硝酸降解產(chǎn)生M及最佳PMP衍生條件，從而進(jìn)一步開發(fā)了糖胺聚糖、甲殼胺及衍生物的降解衍生方法。
　　亞硝酸降解的糖胺聚糖產(chǎn)物經(jīng)過HPLC分離電噴霧電離質(zhì)譜檢測(cè)，通過一些已知結(jié)構(gòu)的化學(xué)合成糖胺聚糖

8、類似物如肝素五糖的亞硝酸降解產(chǎn)物，或是特殊脫硫產(chǎn)物來確定肝素/硫酸乙酰肝素的亞硝酸降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。還使用二級(jí)質(zhì)譜來分析亞硝酸降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，通過碎片離子判斷硫酸酯位于二糖中的糖胺還是糖醛酸，結(jié)合能水解糖醛酸的酶來消去部分亞硝酸降解二糖來確定其結(jié)構(gòu)，通過這一系列確認(rèn)結(jié)構(gòu)手段的聯(lián)合使用，闡述了肝素類糖胺聚糖的亞硝酸降解產(chǎn)物的所有結(jié)構(gòu)。運(yùn)用亞硝酸降解分析市場(chǎng)上常見的低分子肝素（依諾肝素，那曲肝素，達(dá)納肝素），分析由不同制備方法生產(chǎn)的低分子肝素結(jié)構(gòu)

9、上的差異，測(cè)試該方法的檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)線性范圍等等。對(duì)比傳統(tǒng)肝素類結(jié)構(gòu)解析和質(zhì)量控制方法，使用肝素酶ⅠⅡⅢ來降解肝素和低分子肝素并用傳統(tǒng)方法來分析我們實(shí)驗(yàn)中所用的肝素/低分子肝素，驗(yàn)證新開發(fā)用于肝素類結(jié)構(gòu)解析，質(zhì)量控制方法的準(zhǔn)確性，比較兩種方法的優(yōu)劣。分析硫酸軟骨素類糖胺聚糖，硫酸角質(zhì)素，硫酸乙酰肝素，必須先經(jīng)過脫乙酰處理得到能和亞硝酸反應(yīng)的自由氨基，本文還對(duì)含有大量乙酰的糖胺聚糖進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)優(yōu)化得到全脫乙酰糖胺聚糖進(jìn)行亞硝酸降解得到

10、全部結(jié)構(gòu)信息。
　　甲殼胺和甲殼素的差異在于糖鏈中的乙酰取代程度，乙酰度是甲殼胺質(zhì)量控制唯一參數(shù)。我們使用亞硝酸降解甲殼胺，其專一作用于無取代的氨基糖，不影響N-乙酰氨基葡萄糖。形成2，5脫水甘露糖，或是N-乙酰氨基葡萄糖-2，5脫水甘露糖寡糖，通過亞硝酸降解PMP衍生HPLC-UV分析，可以測(cè)算出乙酰度。使用傳統(tǒng)的乙酰測(cè)定方法如滴定/1H-NMR驗(yàn)證得到一致結(jié)果。這一分析甲殼胺的方法還可以用于測(cè)定甲殼胺中的N-乙酰氨基葡萄糖的分

11、布，及聚合度，我們使用化學(xué)乙酰方法合成較高乙酰度的甲殼胺，經(jīng)過我們新開發(fā)的亞硝酸降解PMP衍生方法分析結(jié)果顯示其乙酰度上升寡糖聚合度可高達(dá)11，可見我們的甲殼胺分析方法可以作為甲殼胺質(zhì)量控制的指紋圖譜。合成甲殼胺的衍生物磺化甲殼胺，并使用亞硝酸降解PMP衍生HPLC分析，可以得到和13C-NMR一致的結(jié)構(gòu)信息。
　　基于PMP在分析糖胺聚糖和甲殼胺類多糖中的重要作用，我們合成了兩種氘代PMP，以氘代乙酸為原料合成了1-苯基-3-甲

12、基(D3)-5-吡唑啉酮D3PMP，以氘代苯胺為原料合成了1-苯基(D5)-3-甲基-5-吡唑啉酮D5PMP.將兩種PMP同位素用于標(biāo)記還原性糖，使用質(zhì)譜鑒定三種同位素質(zhì)量數(shù)差別，將PMP同位素用于質(zhì)譜定量，聯(lián)合亞硝酸降解分析不同廠家的低分子肝素差別，同位素標(biāo)記對(duì)比分析豬組織心臟腎臟糖胺聚糖的差異。
　　小結(jié):本文開發(fā)一種化學(xué)降解，PMP柱前衍生HPLC分析解析糖胺聚糖結(jié)構(gòu)及糖胺聚糖質(zhì)量控制方法。使用本論文建立的脫乙酰、亞硝酸降解

13、聯(lián)合PMP柱前衍生方法分析糖胺聚糖二糖，擺脫了對(duì)價(jià)格較高的糖胺聚糖酶的依賴。此方法適用于各種糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)分析，不僅成本低，還具有同時(shí)分析糖胺聚糖混合物這一優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于來源廣價(jià)格低的糖胺聚糖如甲殼胺類，在PMP衍生后的紫外檢測(cè)器就可以達(dá)到結(jié)構(gòu)分析要求。我們新建立的方法還可以使用3種質(zhì)量數(shù)不同的PMP同時(shí)標(biāo)記3種化學(xué)降解了的糖胺聚糖樣品，用色譜質(zhì)譜聯(lián)用定性定量比較3種混合進(jìn)樣的糖胺聚糖結(jié)構(gòu)上的相同與不同，從而為未來糖胺聚糖藥物開發(fā)與質(zhì)量控制