作為餌料組成亞歷山大藻對(duì)扇貝質(zhì)量安全形成的影響.pdf

1、麻痹性貝類毒素（Paralytic Shellfish Toxins,PSTs）是世界上分布最廣、危害最嚴(yán)重的一種貝類毒素。作為 PSTs主要的產(chǎn)毒藻，亞歷山大藻(Alexandium spp.)在自然海水里廣泛分布和存在，具有嚴(yán)重的食品安全和生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)。而目前在食品安全方面，PSTs的研究大多集中于產(chǎn)毒藻環(huán)境分布及 PSTs在水生生物體內(nèi)蓄積、分布和消除等規(guī)律的研究，少見PSTs內(nèi)源代謝輪廓這一重要過程的研究；在生態(tài)安全方面，研究多

2、集中于PSTs對(duì)生物個(gè)體攝入外源能量的抑制作用，而未見對(duì)生物細(xì)胞水平能量利用的干擾機(jī)制的研究。因此，本研究充分考慮有毒甲藻作為扇貝自然環(huán)境下餌料基礎(chǔ)的組成部分，從營養(yǎng)水平的角度評(píng)估現(xiàn)有養(yǎng)殖水體中單細(xì)胞藻類對(duì)扇貝生理活性的影響；同時(shí)通過扇貝對(duì)有毒藻的攝食、毒素轉(zhuǎn)化過程及生長變化，了解有毒藻作為餌料基礎(chǔ)對(duì)扇貝生長的影響。本研究目的是探討有毒甲藻作為基礎(chǔ)餌料組成，對(duì)扇貝安全（PSTs風(fēng)險(xiǎn)）和質(zhì)量（生長性狀）的復(fù)合影響，為闡述“環(huán)境水平貝類毒素

3、致生物量降低的原因及機(jī)制”這一科學(xué)問題提供探索性研究。
　　1、調(diào)查研究了北黃海獐子島海域浮游植物群落結(jié)構(gòu)組成、營養(yǎng)成分和扇貝胃內(nèi)容物含量，同時(shí)分析比較了10種常見微藻營養(yǎng)成分的差異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：北黃海群落結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜多變，主要是由硅藻和甲藻組成，扇貝胃內(nèi)容物顯示亞歷山大藻等產(chǎn)毒藻是扇貝基礎(chǔ)餌料組成。從營養(yǎng)角度來看，北黃海浮游植物蛋白質(zhì)含量豐富，其中蛋白質(zhì)干重百分比在21.3％～45.5%之間；夏季氨基酸含量偏低，其它季節(jié)氨基

4、酸含量豐富均能滿足貝類生長需求；19號(hào)站位的DHA含量在四季中占首位，含量豐富；實(shí)驗(yàn)室條件下，單種培養(yǎng)的10種微藻營養(yǎng)均十分豐富，4種產(chǎn)毒藻整體營養(yǎng)水平較高，尤其是總蛋白和總脂肪含量顯著高于普通餌料藻，能夠?yàn)樯蓉愄峁┥L所需的基本營養(yǎng)。因此，自然條件下，亞歷山大藻可作為扇貝餌料來源組成，為扇貝生長提供充足的營養(yǎng)來源。
　　2、采用液相色譜-四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜（LC-MS/MS-QTRAP），建立了全部歐盟限量13種PSTs

5、在雙殼貝類中的定性確證和定量測(cè)定的分析方法。樣品經(jīng)乙酸水溶液提取，石墨化碳黑固相萃取凈化，HILIC色譜柱分離，以含2 mmol/L甲酸銨，50 mmol/L甲酸的水和95%乙腈水溶液梯度洗脫；質(zhì)譜采集使用MS/MS-QTRAP獨(dú)有的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）-信息依賴性采集（IDA）-增強(qiáng)子離子掃描（EPI）模式。13種目標(biāo)物在各自相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)不低于0.99。方法的檢出限：GTX5、NEO、STX、dcSTX、dcNEO

6、為10μg/kg，C2、GTX3、GTX4、dcGTX3為4μg/kg，C1為13μg/kg，dcGTX2為14μg/kg，GTX1和GTX2為12μg/kg。13種PSTs毒素在檢出限下按毒性因子轉(zhuǎn)換后相當(dāng)于62μg STX eq./kg，基質(zhì)加標(biāo)回收率在70.3%~105.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.45%~13.8%。該方法有效降低貝類基質(zhì)抑制效應(yīng)，簡化前處理過程并減少樣品稀釋，顯著提高方法靈敏度，使同分異構(gòu)體達(dá)到基線分

7、離，適用于雙殼貝類中PSTs的監(jiān)控分析。
　　3、將櫛孔扇貝（Chlamys farreri）直接暴露于產(chǎn)毒藻，通過比較各組織器官中毒素的蓄積及代謝轉(zhuǎn)化特異性，研究PSTs在櫛孔扇貝體內(nèi)危害形成的過程。結(jié)果顯示，分布于中國的一株塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense, AT5-3株），其生長及產(chǎn)毒性狀穩(wěn)定，產(chǎn)毒能力強(qiáng)，主要成分為GTX1&4，單細(xì)胞產(chǎn)毒能力為7.95 fmol/cell；暴露實(shí)驗(yàn)按產(chǎn)毒藻與小球藻

8、的生物量比為9:1的配比投喂，櫛孔扇貝對(duì)該產(chǎn)毒藻具有較強(qiáng)攝食能力及PSTs蓄積能力，總體蓄積效率達(dá)到84.4%，最高蓄積濃度為1903μg STX eq./kg，不同組織蓄積毒素含量由高到低依次為內(nèi)臟團(tuán)、性腺、外套膜、閉殼??；內(nèi)臟團(tuán)對(duì)PSTs的代謝能力也最強(qiáng)，是該毒素在櫛孔扇貝體內(nèi)蓄積代謝的靶器官；此外，櫛孔扇貝對(duì)PSTs表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物轉(zhuǎn)化能力，主要轉(zhuǎn)化途徑為：C1→GTX2/dcGTX2，C2→GTX3。本研究中，櫛孔扇貝對(duì)PSTs

9、總體呈現(xiàn)出迅速蓄積和緩慢代謝的特點(diǎn)，同時(shí)，GTX1&4和NEO等高毒成分所占比例較高，造成扇貝中PSTs毒性和風(fēng)險(xiǎn)性均顯著升高。本研究有助于科學(xué)評(píng)估PSTs危害的形成機(jī)制，為系統(tǒng)監(jiān)控我國PSTs風(fēng)險(xiǎn)性提供科學(xué)支撐。
　　4、通過暴露實(shí)驗(yàn)研究PSTs對(duì)櫛孔扇貝內(nèi)臟團(tuán)和鰓組織超微結(jié)構(gòu)的毒理學(xué)作用，同時(shí)經(jīng)檢測(cè)內(nèi)臟團(tuán)和鰓組織中抗氧化防御系統(tǒng)中氧化還原酶的變化，進(jìn)一步研究PSTs對(duì)櫛孔扇貝內(nèi)臟團(tuán)和鰓組織的毒理學(xué)脅迫作用以及對(duì)其生長的影響。實(shí)

10、驗(yàn)結(jié)果顯示：暴露實(shí)驗(yàn)過程中，在PSTs的作用下櫛孔扇貝內(nèi)臟團(tuán)和鰓組織的超微結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)了病理變化，內(nèi)臟團(tuán)的腸上皮細(xì)胞空泡化，細(xì)胞核萎縮變形，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞壞死裂解；暴露前期，鰓組織柱狀上皮細(xì)胞中線粒體和溶酶體增多且聚集，后期上皮細(xì)胞腫脹破裂，粘液細(xì)胞大量釋放粘液顆粒。暴露實(shí)驗(yàn)初期，內(nèi)臟團(tuán)和鰓組織內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)中的氧化還原酶被激活，MDA含量增多，脂質(zhì)發(fā)生過氧化，相應(yīng)的GSH-PX和POD酶活力均增強(qiáng)，粒細(xì)胞分泌的ACP活力增強(qiáng)，NADPH