急性冷應(yīng)激大鼠組織和細(xì)胞熱休克蛋白90表達(dá)及應(yīng)激性損傷機(jī)理研究.pdf

1、研究背景：突如其來(lái)的大雪和冰凍等極端氣候使機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的冷應(yīng)激反應(yīng)。應(yīng)激性損傷受到廣泛關(guān)注。冷刺激時(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌激素水平發(fā)生改變，釋放大量?jī)翰璺影泛吞瞧べ|(zhì)激素，使內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，生理功能紊亂。這些應(yīng)激激素水平的升高，既能反映應(yīng)激的嚴(yán)重程度，同時(shí)能影響機(jī)體的炎癥免疫反應(yīng)。熱休克蛋白90(HSP90)是重要的應(yīng)激性蛋白之一，應(yīng)激反應(yīng)時(shí)迅速合成并激活，在蛋白質(zhì)聚集、折疊、跨膜、運(yùn)輸和轉(zhuǎn)位、穩(wěn)定細(xì)胞骨架以及分子伴侶等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，抵抗

2、早期應(yīng)激性損傷。HSP90表達(dá)的增強(qiáng)，反映了機(jī)體適應(yīng)和保護(hù)機(jī)制發(fā)揮作用，同時(shí)也說(shuō)明應(yīng)激可能造成了細(xì)胞功能受損。但目前較少研究通過(guò)系統(tǒng)觀察組織細(xì)胞HSP90的表達(dá)評(píng)價(jià)機(jī)體冷應(yīng)激性損傷程度。
　　 應(yīng)激原的作用下HSPs可以“主動(dòng)”分泌出胞或者由壞死細(xì)胞釋放到細(xì)胞外作為損傷相關(guān)模式分子(DAMPs)介導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng)，造成組織細(xì)胞的“二次損傷”。有研究中發(fā)現(xiàn)，重癥創(chuàng)傷后，糖皮質(zhì)激素(GC)分泌增多，肝臟糖皮質(zhì)激素受體(GR)減少時(shí)HS

3、P70表達(dá)增加，以對(duì)抗GR下降所致的臟器損害，但機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)失控，發(fā)生明顯的繼發(fā)性損害。研究發(fā)現(xiàn)釋放到細(xì)胞外HSP70，可能作為免疫系統(tǒng)的危險(xiǎn)信號(hào)(danger signal)，改變免疫微環(huán)境，與抗原遞呈細(xì)胞相互作用而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，或是與單核細(xì)胞表面的TLR4受體結(jié)合，啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答，促進(jìn)TNF-a、IL-6分泌，誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)。在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的研究發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定斑塊中HSP60可作為抗原，誘導(dǎo)特異性T淋巴細(xì)胞的亞型CD28

4、克隆發(fā)生改變，增殖成一群功能多樣的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞。在自身免疫性疾病研究中發(fā)現(xiàn)CD4+CD28-T是一類具有天然殺傷靶細(xì)胞作用，且能抗自身細(xì)胞凋亡長(zhǎng)壽的T細(xì)胞。目前CD4+CD28-T細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制不明確，推測(cè)可能是由有限數(shù)量的抗原刺激產(chǎn)生，尋找誘導(dǎo)CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞增殖的抗原具有重要的臨床意義。有學(xué)者提出在應(yīng)激損傷的過(guò)程中，細(xì)胞外的HSPs作為“交通樞紐”影響和放大周?chē)?xì)胞的炎癥免疫損傷，但是目前分泌和調(diào)節(jié)機(jī)制不

5、明，于是提出HSPs在應(yīng)激性損傷中作用有廣闊的研究空間。最近的研究發(fā)現(xiàn)，用H2O2作用內(nèi)皮細(xì)胞后在培養(yǎng)液中檢測(cè)到可溶性的HSP90，內(nèi)皮細(xì)胞的HSP90表達(dá)升高，加入T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后檢測(cè)到炎癥因子表達(dá)升高，推測(cè)HSP90可能也是DAMP。但是更深入的研究目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此本研究探討在急性冷應(yīng)激中異常升高的HSP90，參與急性冷應(yīng)激主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。
　　 研究通過(guò)觀察急性冷刺激的不同時(shí)間HSP90在大鼠主動(dòng)脈、脾臟和

6、心肌組織、淋巴細(xì)胞的蛋白表達(dá)和血漿濃度的動(dòng)態(tài)變化，從蛋白分子的角度闡述大鼠急性冷應(yīng)激的損傷過(guò)程。通過(guò)研究外源性HSP90誘導(dǎo)急性冷刺激后主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)機(jī)制，探討HSP90啟動(dòng)TLR-4介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)，參與大鼠急性冷應(yīng)激后主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。通過(guò)觀察外源性的HSP90介導(dǎo)，急性冷刺激后大鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和抗原遞呈功能增強(qiáng)，及脾臟T淋巴細(xì)胞激活和亞型的改變。以及HSP90特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷

7、作用。并進(jìn)一步觀察HSP90作為免疫抗原能誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性作用的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞增殖。探討HSP90通過(guò)抗原提呈激活獲得性免疫反應(yīng)參與大鼠急性冷刺激后主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。
　　 一、大鼠急性冷應(yīng)激反應(yīng)中激素、HSP90的動(dòng)態(tài)變化及應(yīng)激性損傷模型建立
　　 通過(guò)系統(tǒng)觀察冷刺激的不同時(shí)間及冷刺激后的不同時(shí)間大鼠血漿兒茶酚胺和激素濃度的改變，檢測(cè)大鼠心肌組織、胸主動(dòng)脈、脾臟和外周血淋巴細(xì)胞以及血漿中HSP90

8、的動(dòng)態(tài)變化。觀察在冷應(yīng)激性損傷模型建立過(guò)程中，大鼠主動(dòng)脈組織HSP90與GR蛋白的表達(dá)。為進(jìn)一步探討HSP90參與大鼠急性冷應(yīng)激主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 1.大鼠急性冷應(yīng)激反應(yīng)中血漿兒茶酚胺和激素的動(dòng)態(tài)變化
　　 方法：大鼠在-4℃氣候箱中冷刺激1h、3h、6h、12h、24h五個(gè)不同的時(shí)間，以及在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)停止冷刺激后置于24℃環(huán)境中進(jìn)一步觀察即刻(0h)、1h、12h、24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。采用放射免疫

9、分析法(ELSA)，檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿腎上腺素(E)和去甲腎上腺素(NE)，促腎上腺素(ACTH)和糖皮質(zhì)激素(Cor)濃度。
　　 結(jié)果：-4℃冷刺激6h開(kāi)始大鼠血漿E和NE濃度開(kāi)始升高，12h達(dá)峰值，E和NE濃度分別是(9.11±0.52ng/ml；12.12±0.37pg/ml)比正常值(4.91±0.12ng/ml；3.13±0.12pg/ml)明顯升高(P<0.01)，以后逐漸下降，24h恢復(fù)期到正常。ACTH在6

10、h時(shí)達(dá)峰(22.4±0.62 pg/ml)比冷刺激前(12.36±0.33pg/mL)明顯升高(P<0.01)，24h降至冷刺激之前水平。Cor在6h開(kāi)始升高，12h時(shí)達(dá)峰值(112.2±0.82ng/ml)明顯高于應(yīng)激前(70.12±0.23ng/ml)水平(P<0.01)。冷刺激結(jié)束后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察E和NE的濃度變化不大。ACTH血漿濃度在冷刺激12h停止冷刺激后的1h(18.14±0.81pg/mL)高于冷刺激前水平(P<0.05

11、)，在12h和24h時(shí)無(wú)明顯升高。而Cor血漿濃度在冷刺激12h停止冷刺激后的12h和24h(133.14±0.52；121.2±0.28)ng/mL明顯高于冷刺激前(70.12±0.23 ng/ml)水平(P<0.01)。大鼠急性冷刺激12h，兒茶酚胺和激素水平均明顯升高，在停止冷刺激后，Cor血漿濃度仍然較高，且Cor與ACTH濃度升高不一致，推測(cè)Cor升高可能不完全依賴于下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的調(diào)節(jié)，可能與HSP90的表達(dá)增強(qiáng)

12、和糖皮質(zhì)激素受體減少有關(guān)。
　　 2.HSP90在急性冷應(yīng)激大鼠血漿、組織和細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化
　　 方法：采用Western_blotting方法檢測(cè)大鼠急性冷應(yīng)激反應(yīng)中心肌組織、胸主動(dòng)脈、脾臟和外周血淋巴細(xì)胞HSP90的蛋白表達(dá)，將蛋白表達(dá)膠片進(jìn)行掃描，用Sicon Image J軟件對(duì)Western b10t條帶進(jìn)行灰度分析，然后計(jì)算蛋白相對(duì)含量：蛋白相對(duì)含量=(HSP90/β-actin)；用ELISA法檢測(cè)血漿H

13、SP90濃度。
　　 結(jié)果：在冷刺激3h時(shí)，心肌組織中的HSP90蛋白表達(dá)量明顯升高，在3h、6h、12h表達(dá)量(1.2±0.02；1.1±0.17；1.05±0.01)比冷刺激前明顯升高(P<0.01)，隨后接近正常水平；大鼠主動(dòng)脈組織中HSP90表達(dá)在冷刺激6h開(kāi)始升高，12h和18h表達(dá)量(1.5±0.05；1.4±0.06)比冷刺激前明顯升高(p<0.05)，24h開(kāi)始下降但高于正常水平。大鼠淋巴細(xì)胞中HSP90的表達(dá)量

14、在冷刺激1h就升高，比冷刺激前明顯升高(P<0.05)，在3h雖有所下降，但一直保持較高水平比冷刺激前明顯升高(P<0.05)，在12h和24h時(shí)升高更明顯，在12h時(shí)達(dá)峰值，表達(dá)量(1.5±0.13)比冷刺激前顯著升高(P<0.01)。脾臟中HSP90的表達(dá)，在冷刺激最初反應(yīng)較慢，在12h、18h表達(dá)量(0.67±0.15；0.6±0.14)比冷刺激前明顯升高(P<0.05)。血漿HSP90濃度，在冷刺激最初時(shí)間無(wú)明顯改變，在12h(

15、0.61±0.03)ug/ml比冷刺激前明顯升高(P<0.05)，在18h和24h一直在較高的水平。在冷刺激結(jié)束后不同的時(shí)間點(diǎn)觀察到：冷刺激結(jié)束后對(duì)心肌HSP90影響不大。而主動(dòng)脈冷刺激12h結(jié)束后，HSP90的表達(dá)在6h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)均處于高水平。血漿淋巴細(xì)胞在冷刺激12h結(jié)束后HSP90表達(dá)量一直處于高水平。脾臟冷刺激12h結(jié)束后6h、12h、24h HSP90表達(dá)量均明顯高于冷刺激前(P<0.05)，血漿HSP90濃度，冷

16、刺激12h結(jié)束后12h明顯升高，一直保持較高的水平，但是在冷刺激24h后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，血漿HSP90濃度是下降。
　　 3.HSP90和8R在大鼠急性冷應(yīng)激主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型建立中的表達(dá)
　　 方法：依據(jù)前面的研究實(shí)驗(yàn)分為四組：冷刺激12h后的即刻，(0h組、12h組、24h組)和冷刺激前組。用光學(xué)顯微鏡和透視電鏡觀察大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜的病理改變，用ELISA法檢測(cè)血漿ET、N0和LDH濃度。Western-blottin

17、g方法檢測(cè)主動(dòng)脈HSP90和GR蛋白表達(dá)量及相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果：大鼠胸主動(dòng)脈病理檢查，光鏡可見(jiàn)0h組：內(nèi)膜不光滑，血管壁層次清晰，中膜可見(jiàn)輕度腫脹。但是冷刺激后12h組和24h組，血管腔凹凸不平，內(nèi)膜增厚，中膜可見(jiàn)腫脹，且彈性纖維排列不整齊，但是兩組之間沒(méi)有顯著差別；電子透視鏡檢查冷刺激前主動(dòng)脈內(nèi)膜表現(xiàn)，冷刺激前內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形、扁平，表面平滑，細(xì)胞膜完整；0h組內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜不完整有破損和缺失，細(xì)胞核碎裂、溶解；12h組和

18、24h組內(nèi)皮細(xì)胞明顯變大，呈空泡狀連成一片，核固縮。冷刺激12h后的0h組、12h組和24h組：大鼠血漿ET濃度(138.55±5.78；173.24±11.23；168.08±12.12)ng/ml比冷刺激前明顯升高(p<0.01)；12h組和24h組比0h組明顯升高(P<0.05)。N0濃度(45.12±8.27；31.21±8.24；22.45±12.9)umol/L比冷刺激前明顯降低(p<0.01)；12h組和24h組比0h組明

19、顯降低(P<0.05)。LDH濃度(372±13.24；435±21.31；473±12.21)IU/L比冷刺激前明顯升高，(p<0.01)；12h組和24h組比0h組明顯升高(P<0.05)。急性冷刺激12h后大鼠主動(dòng)脈組織中HSP90的蛋白表達(dá)量在0h組表達(dá)量為(0.89±0.16)比對(duì)照組升高，(p<0.05)。在12h組表達(dá)量為(1.23±0.22)和24h組表達(dá)量(1.4±0.25)比0h組明顯升高(p<0.01)，兩組之間比

20、較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GR在主動(dòng)脈組織中的蛋白表達(dá)量，在0h組為(0.92±0.012)h比對(duì)照組表達(dá)量明顯升高(p<0.05)。而在12h組和24h組分別為(0.61±0.092；0.42±0.082)比0h組明顯降低(p<0.01)。相關(guān)性分析，在冷刺激12h后12h組和24h組HSP90和GR的蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)r=-0.537，p<0.05
　　 第一部分小結(jié)：
　　 (1)在冷刺激12h后，糖皮質(zhì)激素下降緩慢仍保持

21、在較高水平。
　　 (2)在冷刺激12h后主動(dòng)脈組織，脾臟和外周血淋巴細(xì)胞HSP90表達(dá)增加，同時(shí)HSP90血漿濃度明顯升高。
　　 (3)急性冷刺激12h后12h和24h主動(dòng)脈組織GR表達(dá)量下降，HSP90表達(dá)量升高，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷加重。確定急性冷刺激12h后為本實(shí)驗(yàn)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。
　　 二、外源性HSP90誘導(dǎo)冷應(yīng)激損傷后大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的機(jī)制
　　 通過(guò)觀察外源性H

22、SP90刺激冷應(yīng)激損傷后大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的TLR-4蛋白和TNF-α和IL-6炎性因子mRNA的表達(dá)，及TLR-4特異性阻斷抗體干預(yù)后HSP90誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的變化，探討HSP90啟動(dòng)TLR-4先天性免疫反應(yīng)參與急性冷應(yīng)激后主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
　　 方法：采用原代培養(yǎng)急性冷刺激后各組主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，用外源性的HSP90刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，western-bloting方法檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞TLR-4蛋白表達(dá)，用

23、熒光定量PCR檢測(cè)TNF-α和IL-6炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及TLR-4特異性阻斷抗體干預(yù)后血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6炎性細(xì)胞因子表達(dá)的變化。用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞液中LDH的濃度。
　　 結(jié)果：在急性冷刺激12h后大鼠主動(dòng)脈組織中在0h組TLR4蛋白表達(dá)量為(0.69±0.06)比對(duì)照組升高，p<0.05。在12h組表達(dá)量為(0.93±0.22)和24h組表達(dá)量(0.98±0.25)比對(duì)照組明顯升高(p<0.01)；HS

24、P90處理后各組細(xì)胞的炎癥因子TNF-a和IL-6mRNA表達(dá)量0h組(6.31±0.63和7.31±0.15)倍；12h組分別是(8.24±0.17和10.1±0.11)；24h組(9.12±0.16和11.1±0.15)，各組均上調(diào)，比對(duì)照組明顯升高(p<0.01)。0h組(422.31±7.53)IU/L；12h組是(568.24±9.17)IU/L；24h組(598.12±9.16)IU/L各組均上調(diào)，比對(duì)照組明顯升高(p<0.

25、01)。
　　 第二部分小結(jié)：
　　 (1)外源性的HSP90誘導(dǎo)冷應(yīng)激損傷后大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞TLR4表達(dá)升高，且12h組和24h組比對(duì)照組TLR4蛋白表達(dá)量明顯升高，TNF-a mRNA和IL-6mRNA表達(dá)明顯升高，LDH活性升高。
　　 (2)用TLR4特異性抗體阻斷TLR4后，抑制HSP90誘導(dǎo)的各組內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子TNF-a mRNA和IL-6mRNA表達(dá)。
　　 (3)TLR4介導(dǎo)HSP90

26、誘導(dǎo)急性冷刺激后大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎性因子表達(dá)。
　　 三、外源性HSP90介導(dǎo)急性冷應(yīng)激大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞自身免疫損傷的機(jī)制
　　 通過(guò)觀察外源性的HSP90介導(dǎo)冷應(yīng)激損傷后大鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)成熟和抗原遞呈能力增強(qiáng)，脾臟T淋巴細(xì)胞活性和CD4+T淋巴細(xì)胞亞型的改變。以及HSP90介導(dǎo)的應(yīng)激損傷后特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷的作用。并進(jìn)一步觀察HSP90抗

27、原遞呈能誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性作用的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞增殖。探討HSP90通過(guò)抗原提呈激活獲得性免疫反應(yīng)，參與大鼠急性冷刺激后主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制。
　　 1.外源性HSP90對(duì)冷應(yīng)激損傷后大鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞功能影響
　　 方法：分離培養(yǎng)冷刺激后大鼠脾臟DC和T淋巴細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞的共同刺激分子CD86百分比，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)DC對(duì)同種異體T淋巴細(xì)胞的刺激能力，通過(guò)3H-TdR

28、摻入法，用CPM值表示T淋巴細(xì)胞增殖的能力，用ELISA法測(cè)定MLR上清液中的IFN-γ，TNF-β，IL-4和IL-10細(xì)胞因子。采用3H-TdR摻入法檢測(cè)刀豆素(ConA)抗原刺激脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組CD43、淋巴細(xì)胞的亞型以及用ELISA法檢測(cè)HSP90與各組T淋巴細(xì)胞細(xì)胞液中IFN-γ濃度。
　　 結(jié)果：①在12h組和24h組的大鼠脾臟DC表面CD86百分比冷刺激前和0h組明顯增高，對(duì)同種異體T淋巴細(xì)

29、胞刺激增殖的CPM值(26，334±4532；32，34±3127)比冷刺激前組CPM值(8，599±5745)明顯升高(p<0.01)，同時(shí)細(xì)胞液中細(xì)胞因子IFN-γ，TNF-β濃度(12h組，15.6±1.4；16.3±1.1)ng/L(24h組，18.1±2.1；19.0±1.4)ng/L比冷刺激前(6.8±1.1；7.4±1.9)ng/L明顯升高(p<0.01)。②在12h組和24h組的大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的CD4CD28-T淋巴

30、細(xì)胞(73±10.5；80±11.2)％比冷刺激前百分比明顯升高(p<0.01)。③5.0ug/ml ConA刺激各組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞在12h組cmp值=16，520±3421和24h組cmp值=18，230±7812比冷刺激前明顯升高(p<0.01)。④ HSP90與各組T淋巴細(xì)胞細(xì)胞液中IFN-γ濃度結(jié)果：12h組(14.4±1.1)ng/L和24h組(15.8±1.6)ng/L冷刺激前明顯升高(p<0.01)。
　　 2

31、.外源性HSP90誘導(dǎo)CD4+CD28-T增殖的研究
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分為，10ug/LHSP90負(fù)載DC；20ug/LHSP90負(fù)載DC組和對(duì)照組。用密度梯度離心法分離人外周血(PBMC)，體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察HSP90負(fù)載DC細(xì)胞(HSP90-DC)，免疫磁珠分選技術(shù)獲得CD4+T淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T亞型CD28的百分比，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中INF-γ細(xì)胞因子的濃度。用realtime RT-PCR，通過(guò)循

32、環(huán)閾值(Ct)表達(dá)，7300pcr儀器軟件分析結(jié)果，用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA值，檢測(cè)HSP90-DC細(xì)胞誘導(dǎo)的CD4CD28-T淋巴細(xì)胞INF-γ、IL-2、TNF-a和GZMBmRNA值，用CFSE標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，流式細(xì)胞術(shù)百分比來(lái)表示CD4CD28-T淋巴細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)阿托伐他汀干預(yù)HSP90負(fù)載DC細(xì)胞對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果：①免疫磁珠分選技術(shù)獲得CD4+T淋巴

33、細(xì)胞純度在(95±1.5)％，HSP90負(fù)載DC能誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞CD28表達(dá)下，10ug/LHSP90-DC和120ug/LHSP90-DC誘導(dǎo)CD4+CD28-T細(xì)胞百分比分別是(65±11.2；70±9.8％)比沒(méi)有HSP90負(fù)載的DC組誘導(dǎo)CD4+CD28-T細(xì)胞百分比(22±7.9)％明顯升高的(p<0.01)，細(xì)胞液INF-γ濃度10ug/LHSP90-DC組(14.3±1.26)ng/L和20ug/LHSP90-DC

34、組(15.4±1.15)ng/L比對(duì)照組明顯升高(p<0.01)，兩個(gè)濃度的HSP90-DC組之間比較沒(méi)有差別；②阿托伐他汀抑制HSP90負(fù)載DC細(xì)胞對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖的影響，阿托伐他汀組CD4+CD28-T細(xì)胞百分比(23.5±5.3)％比未干預(yù)組(57.24±2.3)％明顯降低(p<0.01)；細(xì)胞液中INF-γ濃度阿托伐他汀組(7.8±0.6)ng/L比未干預(yù)組(15.7±0.5)ng/L明顯降低(p<0.01)。③定量PC

35、R檢測(cè)HSP90-DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD28-T細(xì)胞的INF-γ、IL-2、TNF-a、GZMBmRNA表達(dá)值比對(duì)照組明顯升高(p<0.01)。而且HSP90-DC和CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞混合組血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(10±11.2)％比對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞增殖量(45±15.3)％明顯降低(p<0.01)。
　　 3.HSP90介導(dǎo)冷應(yīng)激后特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究
　　 方法：分離冷刺激大鼠1

36、2h后0h組、12h組和24h組的脾臟DC和T淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組DC刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖，用MTT法檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞的殺傷率(％)=(效應(yīng)細(xì)胞孔A值+單純靶細(xì)胞孔A值-細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)孔A值)/單純靶細(xì)胞孔A值×100％，檢測(cè)各組的DC細(xì)胞和自體的T淋巴細(xì)胞混合(CTL)對(duì)靶細(xì)胞大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(EC)與負(fù)載HSP90-EC細(xì)胞殺傷作用的比較；進(jìn)一步用CFSE標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用阿托伐他(Ato)的干預(yù)后免疫細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增

37、殖的影響以及用ELISA法檢測(cè)混合細(xì)胞液的LDH濃度。
　　 結(jié)果：①各組DC刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖觀察到，冷刺激后12h和24h組的T細(xì)胞增殖(19.5±1.5；32±5.4)％比正常對(duì)照組(2.8±0.5)％明顯升高(p<0.01)；負(fù)載HSP90后的正常組DC刺激自體淋巴細(xì)胞增殖(42.1±5.4)％顯著增強(qiáng)(p<0.01)。②12h組和24h組DC細(xì)胞和自體的T淋巴細(xì)胞混合(CTL)對(duì)負(fù)載HSP90的內(nèi)皮細(xì)胞組的殺傷率(

38、68.3±1.4；71.3±2.7)％比未負(fù)載HSP90的大鼠內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷率(13.4±1.9；15.6±2.3)％比較明顯升高(P<0.01)；各組CTL中加入CD4+CD28-T可以明顯增強(qiáng)這一細(xì)胞毒性作用，各組之間負(fù)載HSP90內(nèi)皮細(xì)胞組比未負(fù)載HSP90內(nèi)皮細(xì)胞組殺傷率明顯升高(P<0.01)。③冷刺激12h后12h組和24h組的DC及HSP90負(fù)載的DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)負(fù)載HSP90-EC有高度的殺傷作用，Ato能明顯抑制CT

39、L對(duì)負(fù)載HSP90-EC的殺傷作用，Ato組內(nèi)皮細(xì)胞增殖(60±10.5)％比對(duì)照組明顯升高(p<0.01)；且細(xì)胞液中LDH濃度Ato組(125±16.5)IU/L比對(duì)照組(270±14.8)IU/L明顯降低(p<0.01)。
　　 第三部分小結(jié)：
　　 (1)冷應(yīng)激12h后12h組和24h組，大鼠脾臟DC功能成熟，抗原遞呈能力增強(qiáng)；脾臟T淋巴細(xì)胞HSP90特異性致敏，CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分比顯著增加。

40、>　　 (2)體外試驗(yàn)證實(shí)HSP90負(fù)載的DC能誘導(dǎo)CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞增殖，而且CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞炎性細(xì)胞因子INF-γ、IL-2、TNF-a和GZMBmRNA的表達(dá)升高，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，阿托伐他汀能抑制HSP90誘導(dǎo)CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞增殖，能降低細(xì)胞液中INF-γ濃度。
　　 (3)冷應(yīng)激12h后12h組和24h組，大鼠脾臟DC及HSP90負(fù)載的DC誘導(dǎo)自體的，特異性細(xì)胞毒性

41、T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)負(fù)載HSP90-EC有高度的損傷作用，各組中加入CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞對(duì)負(fù)載HSP90-EC的殺傷作用明顯增強(qiáng)，阿托伐他汀能明顯抑制HSP90介導(dǎo)的CTL對(duì)HSP90負(fù)載內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷作用。
　　 (4)初步驗(yàn)證了HSP90可以作為特異性抗原，誘導(dǎo)CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞增殖，參與對(duì)負(fù)載HSP90的血管內(nèi)皮細(xì)胞的自身免疫損傷作用。
　　 (5)阿托伐他汀能干預(yù)HSP90誘導(dǎo)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞