熱休克蛋白90與細胞骨架蛋白在氧化應激及預適應中作用的探討.pdf

1、研究背景: 細胞代謝和外源性因素引起的細胞氧化/抗氧化平衡紊亂，損害脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸功能，從而導致氧化應激，見于多種疾病中[1]。在細胞模型中，高溫、氧化劑處理可導致氧化應激，與多種信號轉(zhuǎn)導通路的激活機制有關(guān)[2,3]。另一方面，一定程度的氧化應激，可增強細胞、機體適應能力，并與某些應激保護性蛋白的合成有關(guān)[4，5]。在眾多氧化應激研究中對損傷機制已有較深入的研究，而對氧化應激適應的機制研究不夠，而這兩個環(huán)節(jié)是環(huán)境因素傷害作用

2、與機體抵御氧化應激傷害應答中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。氧化應激適應的生物學機制的探索，將有助于能闡明機體對應激適應的分子機制，為探討相關(guān)疾病的機理、疾病治療、疾病預防和新藥開發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。 氧化應激狀態(tài)下機體蛋白質(zhì)表達譜研究的深入[6]為進一步探討氧化應激與適應的分子機制奠定了基礎(chǔ)。SWISS-PORT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中可檢索到220種與人類應激相關(guān)的蛋白質(zhì)。熱休克蛋白90(heatshockprotein，Hsp90)是公認的與應激適應

3、密切相關(guān)的保護性分子，可在共作用伴侶蛋白(co-chaperones)的協(xié)助下，調(diào)節(jié)底物蛋白折疊、聚合來保護其生物功能；作為Hsp90底物蛋白的細胞骨架蛋白參與細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡并是維持細胞正常生理功能的關(guān)鍵分子，是氧化應激損傷的早期靶目標[7]。并有研究表明，Hsp90可穩(wěn)定骨架蛋白的聚合[8]，因此，探討兩者在氧化應激預適應中的共作用關(guān)系有助于闡明熱休克蛋白90作為應激保護性分子的作用機制。 目的: 1.通過氧化

4、應激和預適應建立HepG2細胞Hsp90的差異表達模型[9]； 2.研究在氧化應激和預適應條件下，HepG2細胞活性和細胞內(nèi)Hsp90和骨架蛋白Tubulin、Vimentin的表達情況的關(guān)系； 3.分析骨架蛋白Tubulin、Vimentin和Hsp90在正常環(huán)境(對照組)、應激、預適應等不同狀態(tài)下的分布和量的變化趨勢，并以此進一步探討熱休克蛋白在氧化應激預適應下對細胞保護作用的分子機制。 方法: 1.

5、建立預適應及氧化應激HepG2細胞模型：將細胞分為對照組(C)、氧化應激組(O)、預適應組(P)和預適應后氧化應激組(P+O)。預適應因素：50μmol/L，H2O2，2h，普通培養(yǎng)基孵育10h，氧化應激因素：500μmol/L，H2O2，24h。通過MTT比色法和Hoechst33342染色法測定和觀察不同條件下的細胞存活情況。 2.以Western-blot檢測不同條件下胞內(nèi)Hsp90及骨架蛋白Tubulin和Vimenti

6、n的差異表達情況。 3.應用免疫熒光方法檢測不同情況下Hsp90及骨架蛋白Tubulin和Vimentin的分布情況。 結(jié)果: 1.MTT比色法測定細胞生存活力：氧化應激明顯降低細胞生存活力(Ov.s.C；P+Ov.s.P，P<0.05)。預適應可提高氧化應激后的細胞生存活力(P+Ov.s.O，P<0.05)。 2.Heochst33342染色法觀察細胞凋亡結(jié)果：氧化應激導致凋亡細胞明顯增多；預適應可明顯

7、減少氧化應激后凋亡細胞數(shù)。 3.預適應和氧化應激對Hsp90和Tubulin、Vimentin的表達量的影響：氧化應激導致胞內(nèi)Hsp90、Tubulin和Vimentin表達量明顯降低(Ov.s.C，P<0.05)。預適應可提高胞內(nèi)Hsp90、Tubulin和Vimentin表達量(Pv.s.C，P<0.05)，并在氧化應激后維持較高水平(P+Ov.s.O，P<0.05)。 4.Hsp90和Tubulin、Vimenti

8、n有相似的細胞內(nèi)分布：不同條件下，體外培養(yǎng)的HepG2細胞中Hsp90的分布與細胞骨架蛋白Tubulin和Vimentin一致。①對照組顯示了正常生理情況下Hsp90和Tubulin及Vimentin在細胞內(nèi)趨勢一致，均勻分布于胞漿和胞核；②而直接應激組中兩種蛋白在胞漿中呈現(xiàn)一致的散在點狀分布，更多聚集于胞核周圍，且總體密度小于對照組；③預適應組兩種蛋白分布，光密度較對照組顯著增加，主要分布于胞漿；④預適應后應激組的光密度與預適應組相比

9、在應激后則輕微減弱，總的光密度和分布范圍略大于直接應激組。 結(jié)論: 1.預適應可增加細胞內(nèi)Hsp90的表達水平并改變其胞內(nèi)分布，從而減輕應激引起的細胞形態(tài)和功能改變，實現(xiàn)再次應激時的保護作用； 2.骨架蛋白Tubulin和Vimentin與應激保護性分子Hsp90在正常環(huán)境(對照組)、應激、預適應等不同條件下的表達水平差異和分布的變化具有相同的趨勢，從而推測Hsp90可能通過協(xié)同信號轉(zhuǎn)導通路平臺--骨架蛋白網(wǎng)絡與