利用PFKFB3的生物節(jié)律性有效抑制舌癌進(jìn)程的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、1.研究背景與目的：
　　生物節(jié)律性對(duì)生物體的行為學(xué)和生理學(xué)的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用，越來(lái)越多的證據(jù)已經(jīng)證實(shí)，生物節(jié)律性紊亂可以提高致癌風(fēng)險(xiǎn)。輪班制工作，飛行時(shí)差反應(yīng)，夜間光污染等均被列為引起生物節(jié)律性紊亂的因素。此外，生物節(jié)律性是否正常也可以作為一個(gè)獨(dú)立影響因子，對(duì)癌癥患者的預(yù)后具有預(yù)測(cè)性?；谏鲜鲆罁?jù)，有學(xué)者提出時(shí)間療法這一概念。由于癌癥細(xì)胞與正常體細(xì)胞表現(xiàn)出不同的生物節(jié)律性，所以時(shí)間療法即是利用這種差異，而給癌癥患者安排藥物

2、或物理治療時(shí)間的方法。而這一療法在癌癥綜合治療及個(gè)性化治療中具有較好的應(yīng)用前景已被眾多研究證實(shí)。然而，生物鐘紊亂對(duì)口腔相關(guān)疾病影響的研究尚較少。
　　近年來(lái)，PFKFB3及其產(chǎn)物iPFK2備受關(guān)注，因?yàn)槠浔蛔C實(shí)為PFKFB家族中作用最強(qiáng)的激酶。iPFK2可以通過(guò)促進(jìn)PFK1，這一糖酵解限速酶的功能，從而大大提高糖酵解反應(yīng)的速率。而早在1927年，學(xué)者Otto Warburg即研究證實(shí)，即使在供氧充足的條件下，癌癥細(xì)胞生物代謝所需能

3、量的80％仍來(lái)源于無(wú)氧代謝——糖酵解過(guò)程，此經(jīng)典供能模式被稱為“Warburg效應(yīng)”。同時(shí)，大量臨床證據(jù)已證實(shí)，PFKFB3在眾多癌癥組織中都呈現(xiàn)出高表達(dá)。針對(duì)PFKFB3研發(fā)出的小分子抑制劑3PO已被作為單一靶向治療藥物正式進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段?？梢?jiàn)，PFKFB3在癌癥細(xì)胞能量代謝中扮演著極其重要的角色。
　　然而，目前為止，并無(wú)相關(guān)研究探究生物節(jié)律性的紊亂或者PFKFB3本身的生物節(jié)律性是否會(huì)影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展。如果能夠找出PF

4、KFB3的生物節(jié)律性與口腔癌癥之間的相互作用，并PFKFB3為藥物靶點(diǎn)，將時(shí)間療法應(yīng)用于口腔癌癥的治療中，無(wú)疑是為口腔癌癥的綜合治療及個(gè)性化治療提供了一個(gè)全新的思路。
　　2.研究材料與方法：
　?。?）將購(gòu)買獲得的人舌癌細(xì)胞系SCC9增殖培養(yǎng)后，采用血清饑餓處理的方法同步化，分6個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞，裂解后提取細(xì)胞的 RNA，采用RT-PCR的方法探索該細(xì)胞PFKFB3，CLOCK，Bmal1，Per1以及Per2的生物節(jié)

5、律性；
　?。?）采用基因測(cè)序的方法獲得PFKFB3啟動(dòng)子全序列，并利用軟件定位出啟動(dòng)子上所有 E-boxes的位置；利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和熒光素酶報(bào)告檢測(cè)技術(shù)證實(shí)CLOCK、Bmal1及其復(fù)合物對(duì)PFKFB3表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，及在不同時(shí)間點(diǎn)下PFKFB3的表達(dá)差異；
　?。?）以SCC9為細(xì)胞模型，以3PO為PFKFB3的靶向抑制劑，利用RT-PCR、細(xì)胞流式等技術(shù)，體外證實(shí)不同時(shí)間點(diǎn)下，3PO抑制PFKFB3表達(dá)的能力是否有所差異

6、，以及時(shí)間療法對(duì)細(xì)胞生物行為的影響。
　　3.研究結(jié)果：
　?。?） PFKFB3基因在舌癌細(xì)胞中表達(dá)具有明顯的生物節(jié)律性，具有早晨表達(dá)被促進(jìn)，夜間表達(dá)被抑制的規(guī)律。生物鐘核心正反饋基因CLOCK在舌癌細(xì)胞表達(dá)的生物節(jié)律性與PFKFB3基因極其相似；而生物鐘核心正反饋基因Bmal1表達(dá)紊亂，持續(xù)被抑制在極低水平；生物鐘核心負(fù)反饋基因 Per1及Per2在舌癌細(xì)胞中表達(dá)的生物節(jié)律性具有雙高峰；
　　（2） PFKFB3啟

7、動(dòng)子上有33個(gè)E-box，其中包括一個(gè)嚴(yán)格的Bmal1/CLOCK復(fù)合體結(jié)合位點(diǎn)（CACGTGA），同時(shí)證實(shí)，CLOCK/Bmal1復(fù)合體對(duì)PFKFB3轉(zhuǎn)錄翻譯的調(diào)控規(guī)律為：增加CLOCK的表達(dá)，可顯著提高PFKFB3基因的轉(zhuǎn)錄水平；而這種作用會(huì)被Bmal1抑制；將CLOCK變異后，PFKFB3基因的表達(dá)幾乎接近正常細(xì)胞水平；因此PFKFB3基因的節(jié)律性表達(dá)中，CLOCK起的作用更為關(guān)鍵；
　?。?）體外不同時(shí)間點(diǎn)給予舌癌細(xì)胞PF

8、KFB3抑制劑3PO刺激，ZT7時(shí)癌細(xì)胞的增殖能力可被顯著抑制，凋亡能力可被顯著促進(jìn)；而ZT19這一時(shí)間點(diǎn)下，藥物效果無(wú)顯著差異；同時(shí)，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)下，PFKFB3抑制劑3PO對(duì)舌癌細(xì)胞的細(xì)胞周期均無(wú)明顯的影響。
　　4.研究結(jié)論：
　　本研究首次從細(xì)胞的基因水平證實(shí)，PFKFB3在舌癌細(xì)胞中不僅表達(dá)量增高，而且具有生物節(jié)律性，這一生物節(jié)律性極有可能受到 CLOCK/Bmal1復(fù)合體的直接調(diào)控，其中 CLOCK可能占有更為主