用血漿多肽組學(xué)初步分離、篩查肺鱗癌血清標(biāo)志物.pdf

1、目的：1.通過(guò)血漿采樣、多肽分離，尋找最大化提取、分離血漿多肽的試驗(yàn)方法。
　　2.展示健康組及各鱗癌組多肽序列，并對(duì)其鑒定，比較分析正常人和肺鱗癌患者多肽差異，初步篩查肺鱗癌的血清標(biāo)志物。
　　方法：用能穩(wěn)定血漿的P100試管（BD公司，美國(guó)）收集健康人血清48例，I期NSCLC標(biāo)本10例，、II期NSCL C患者18例、III期NSCLC患者25例。利用有機(jī)溶劑沉淀法及高效液相色譜法（HPLC）分離多肽，利用基質(zhì)輔助激光

2、解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）展示多肽組并對(duì)結(jié)果進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-Q-TOF-MS）對(duì)各組樣本多肽測(cè)序，在 NCBI蛋白質(zhì)（基因）數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索蛋白或者多肽序列。根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)參考及 MALDI-TOF-MS儀器參數(shù)，我們規(guī)定有效的ID序列將得分不低于20。將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行MS Blast分析。得肺癌病人和健康人血漿多肽組，比對(duì)健康人和肺癌病人多肽組差異。
　　結(jié)果：1.對(duì)于血漿多

3、肽組的幾個(gè)不同收集方法我們進(jìn)行了詳細(xì)的對(duì)比分析。由于肺癌樣本難于采集，方法研究中所有血漿均為正常人血漿。通過(guò)文獻(xiàn),我們進(jìn)行了加熱滅活加高壓凝膠過(guò)濾收集；乙腈變性沉淀加高壓凝膠過(guò)濾收集；乙腈/丙酮變性沉淀加高壓凝膠過(guò)濾收集。三種方法通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)加熱滅活方法中蛋白殘留量最高，有機(jī)溶解變性沉淀方法優(yōu)于加熱滅活方法，故選擇有機(jī)溶劑沉淀為優(yōu)先處理方法。對(duì)于有機(jī)溶劑沉淀，通過(guò)不同乙腈體積倍數(shù)沉淀方法發(fā)現(xiàn)2.5倍乙腈體積優(yōu)于其它倍數(shù)沉淀

4、方法。故我們選擇2.5倍體積乙腈沉淀與混合有機(jī)溶劑沉淀進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)4倍體積乙腈/丙酮/水沉淀優(yōu)于2.5倍體積乙腈沉淀方法，所以我們最終確定采用乙腈/丙酮/水沉淀方法為多肽組提取方法。同時(shí)，我們查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，增加氨水復(fù)溶以增加多肽組回收率。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，最終確定多肽組提取方法為4倍體積混合溶劑（乙腈/丙酮/水=50/30/20）變性沉淀，變性時(shí)間為30分鐘，變性溫度為室溫。
　　2.利用電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-Q-

5、TOF-MS），對(duì)樣本中所含多肽分子進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)H組和LC1+2+3組多肽序列并將搜索到的肽段利用blast MS分析。分析后可得到所含肽鏈對(duì)應(yīng)的蛋白。健康對(duì)照組搜索到852個(gè)肽段，LC1+2+3組搜索到1125個(gè)肽段。兩組肽段Scores評(píng)分均大于20有21個(gè)肽段。蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到對(duì)應(yīng)蛋白。我們利用UniProt(www.uniport.org)篩選出8個(gè)有功能蛋白。八個(gè)蛋白分別是：metastasis-associated pr

6、otein MTA1/3、Matrix metalloproteinase-16 precursor、Cytokerantin-19、 haptoglobin isoform2 preproprotein、breast cancer type1 susceptibility protein isoform4/3/2/1、growth/differentiation factor15 precursor、Complement C3 pre

7、cursor、Complement componment C9。根據(jù)每組蛋白emPAI進(jìn)行非標(biāo)定量分析，統(tǒng)計(jì)得出差異蛋白。故我們推測(cè)蛋白 Matrix metalloproteinase-16 precursor可能為潛在肺鱗癌血清標(biāo)志物。
　　結(jié)論：1.4倍體積混合溶劑（乙腈/丙酮/水=50/30/20）變性沉淀法為提取血漿多肽最有效方法。
　　2.蛋白Matrix metalloproteinase-16 precurs