miR-519-520家族下調人牙周膜細胞MMP-2表達的實驗研究.pdf

1、目的及意義:
　　最初基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)被描述為細胞外基質基板,后因其結構和功能特性定義為一類酶家族。其主要分為三類:膠原酶;明膠酶和基質溶解酶。大量研究表明,膠原酶存在于牙周炎患者的唾液和組織中,并隨著炎癥程度加重而增加,其中最為顯著的是MMP-2,牙周炎經過有效治療MMP-2表達明顯降低。但對于靶向調控MMP-2上游位點還未見報道,目前隨著miRNAs的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展,為牙

2、周炎的研究開辟了新的思路。
　　miRNAs是由21~24核苷酸所組成并且存在于真核細胞當中的一個非編碼小分子RNA,通過抑制蛋白的轉錄和翻譯來調節(jié)細胞行為。miRNAs不僅在細胞凋亡、遷移、增殖、分化等生理過程中發(fā)揮作用,也與炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關系。研究表明,miRNAs具有炎癥負反饋調節(jié)機制,如在牛皮癬患者中觀察到miR-181b可以通過抑制核因子NF-ΚB表達來調節(jié)炎癥反應,同時炎癥性刺激也可減少miR-181b的表達

3、。作為機體內源性小RNA,miRNAs很可能在牙周炎發(fā)生發(fā)展中起到重要的調控作用。
　　牙周膜細胞(peridontal ligament cells,PDLCs)是由Arnold發(fā)現(xiàn)的,其來源于牙周組織,是牙周結締組織的主要間質細胞,在牙周組織的形成和再生過程中起著關鍵作用,PDLCs的增殖和分化在組織再生和修復過程中起重要作用,而PDLCs的凋亡是牙周破壞和修復的重要病理生理過程。
　　我們假設miRNAs可通過調控MM

4、P-2的表達影響牙周炎的發(fā)生發(fā)展。實驗通過生物學信息方法預測可調控MMP-2的miRNAs,并用qRT-PCR和Westernblot驗證在牙周膜細胞中miRNA對MMP-2mRNA和蛋白表達的調控關系,用雙熒光素酶驗證miRNA是否作用于MMP-23’UTR的靶位點。
　　研究方法及步驟:
　　1、生物學信息檢測:通過DIANA-microT;TargetScan和miRanda;PITA四種在線預測軟件預測可能靶向于MM

5、P-23’UTR的miRNAs,以四個預測軟件綜合結果和總分靠前為原則。
　　2、人PDLCs培養(yǎng)與鑒定:在重慶第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院口腔科門診采集因正畸需要拔除的健康、無齲壞的上頜前磨牙,用酶消化組織塊法分離細胞并常規(guī)培養(yǎng);倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)及其變化;取第2代細胞進行免疫組化法檢測細胞表型。
　　3、驗證miRNAs對MMP-2調控:PDLCs被mimics-miRNAs和miRNAs negative con

6、trol(對照組)轉染后,通過qRT-PCR和Western blot檢測細胞中MMP-2mRNA和western blot表達的改變,通過雙熒光素酶驗證基因的靶點,MMP-2野生型及突變型質粒與miRNA模擬物和miRNA抑制劑共同轉染于PDLCs中,negative control與報告質粒共轉染做陰性對照,以GV272為空白對照。
　　研究結果:
　　1、通過在線預測軟件TargetScan;DIANA-microT;

7、miRanda和PITA預測可能靶向于MMP-23’UTR的 miRNAs,綜合四個軟件不同的算法預測出miR-520h;miR-520g;miR-519d-3p;miR-519c-3p;miR-519d五個miRNAs可能靶向MMP-23’UTR。
　　2、連續(xù)培養(yǎng)的人PDLCs增殖快,細胞呈集落狀生長,單個細胞可見2~4個細胞突起;免疫組化法檢測細胞抗角蛋白陰性,抗波形絲蛋白陽性。
　　3、人牙周膜細胞轉染mimics-

8、miRNAs后可觀察到miRNA的表達量與對照組相比明顯上升(P<0.01)。人牙周膜細胞轉染miR-520h-mimics;miR-520g-mimics;miR-519d-3p-mimics;miR-519c-3p-mimics能明顯抑制MMP-2 mRNA和蛋白的表達水平(P<0.05)。但轉染miR-519d-mimics后并沒有引起MMP-2mRNA和蛋白表達的變化(P>0.05)。miR-520h-mimics; miR-5

9、20g-mimics; miR-519d-3p-mimics;miR-519c-3p-mimics分別和野生型MMP-2共轉染PDLCs中可引起熒光素酶活性下降(P<0.05),突變型轉染組熒光素酶活性無明顯變化。miR-519d-mimics和MMP-2野生型質粒轉染入細胞沒有使熒光素酶活性產生變化,與PCR和Western結果一致(P<0.05)。
　　結論:
　　1、通過miRNAs預測軟件的綜合結果預測到5種miRN

10、As:miR-520h、miR-520g、miR-519b-3p、miR-519c-3p、miR-519d可負性調控MMP-2的表達。
　　2、人牙周膜細胞被miR-mimics組轉染后,其miR-520h、miR-520g、miR-519b-3p、miR-519c-3p、miR-519d呈高表達。
　　3、在牙周膜細胞中miR-520h;miR-520g;miR-519b-3p;miR-519c-3p顯著下調MMP-2mR