四個(gè)玉米逆境響應(yīng)蛋白激酶在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的亞細(xì)胞定位.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室從玉米中克隆得到四個(gè)與逆境相關(guān)的蛋白激酶基因(ZmSPKl，ZmPtil，ZmASKl，ZmSIMKl)，受到鹽、甘露醇、脫落酸及低溫等脅迫因子誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)上調(diào)，表明它們可能參與逆境信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。為了進(jìn)一步研究它們?cè)隗w內(nèi)的功能，我們利用生物信息學(xué)方法初步分析了它們?cè)诎麅?nèi)可能的定位情況，然后利用綠色熒光蛋白基因gfp作為報(bào)告基因，構(gòu)建融合基因的植物表達(dá)載體，采用花粉浸醮的方法，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，觀察其在擬南芥細(xì)胞內(nèi)

2、的定位，結(jié)果如下： 利用生物信息學(xué)軟件分析ZmPtil、ZmASKl、ZmSIMKl和ZmSPKl的初級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ZmPtil和ZmASKl的N末端都具有線粒體前導(dǎo)序列，均為可溶性蛋白，推測(cè)它們可能定位于線粒體基質(zhì)內(nèi)。ZmSIMKl和ZmSPKl定位情況較為復(fù)雜，初步推測(cè)它們可能是定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。 構(gòu)建了以35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的四個(gè)融合蛋白ZmX-GFP和游離GFP的植物表達(dá)載體pGZmX-GFP和p

3、G35s-GFP。轉(zhuǎn)入擬南芥中均篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系，用體式熒光顯微鏡觀察它們?cè)诮M織器官內(nèi)的熒光信號(hào)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诟狻⑶o尖等幼嫩組織內(nèi)表達(dá)量高。 激光共聚焦熒光顯微鏡觀測(cè)結(jié)果表明，融合蛋白ZmPtil-GFP的熒光信號(hào)主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，且分布不均勻，推測(cè)該蛋白激酶為可溶性蛋白，定位在特定的細(xì)胞器內(nèi)。結(jié)合生物信息學(xué)分析及該細(xì)胞器大小，我們推測(cè)定位于線粒體內(nèi)。融合蛋白ZmSPKl-GFP的熒光信號(hào)的分布與游離GFP對(duì)照相似

4、，在細(xì)胞基質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)均可見(jiàn)。但是與單獨(dú)表達(dá)GFP的對(duì)照相比，融合蛋白ZmSPKl-GFP在核內(nèi)信號(hào)更強(qiáng)。據(jù)此，我們推測(cè)ZmSPKl是可溶性蛋白，定位在核內(nèi)。 由于未得到熒光表達(dá)較強(qiáng)的轉(zhuǎn)ZmSIMKl融合基因和轉(zhuǎn)ZmASKl融合基因的株系，無(wú)法進(jìn)行這兩個(gè)基因產(chǎn)物的精細(xì)定位。 蛋白質(zhì)的細(xì)胞區(qū)域分布是其功能體現(xiàn)的一個(gè)方面，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究為進(jìn)一步研究它們?cè)谀婢承盘?hào)傳遞中的作用，及其在植物體內(nèi)可能的生物學(xué)功能奠