擬南芥類蛋白激酶基因AtACDO1調(diào)控葉綠素降解及抗氧化的研究.pdf

1、ABC1（for Activity of bcl complex）類蛋白激酶是近年來在植物中發(fā)現(xiàn)的一類新的非典型性激酶。自被發(fā)現(xiàn)之始，就漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，但植物中該激酶的研究較少，對(duì)于其在植物中的功能更相知甚少。本實(shí)驗(yàn)室在擬南芥中克隆到一個(gè)編碼ABC1類蛋白激酶的基因，AtACDO1（ABC1-like Kinase related to Chlorophyll Degradation and Oxidative stress），在

2、對(duì)擬南芥和水稻ABC1基因家族成員進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式的整體研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)擬南芥AtACDO1基因的功能進(jìn)行了深入研究，著重探討該基因在葉綠素代謝以及抗氧化脅迫方面的作用，并探究了其可能的作用機(jī)理。主要取得了以下結(jié)果：
　　 1、擬南芥和水稻ABC1類蛋白激酶家族生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中該家族有17個(gè)成員（AtABC1P1-AtABC1P17）；水稻種有15個(gè)成員（OsABC1P1-OsABC1P15）。該

3、家族所有成員在蛋白質(zhì)序列上含有一個(gè)典型的ABC1結(jié)構(gòu)域，并且具有激酶保守的VAVK-like和DFG-like催化基序。所有32個(gè)成員在進(jìn)化上可分為3個(gè)亞家族，同時(shí)發(fā)現(xiàn)水稻和擬南芥成員間的進(jìn)化關(guān)系較各自物種本身成員之間更近。亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)該家族成員大多定位于葉綠體或線粒體。
　　 2.利用RT-PCR分析了擬南芥和水稻中該家族成員在不同脅迫條件下的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在高光下AtABC1P2、AtABC1P5、AtABC

4、1P17、OsABC1P7、和OsABC1P8表達(dá)水平上調(diào)；而除了AtABC1P2外，幾乎所有AtABC1Ps均在高溫處理時(shí)表達(dá)水平下降。AtABC1P15和OsABC1P8表達(dá)受ABA誘導(dǎo)，而AtABC1P17、OsABC1P1、OsABC1P2以及OsABC1P13的表達(dá)水平被ABA下調(diào)。大部分AtABC1Ps受CdCl2短時(shí)誘導(dǎo)；而大部分OsABC1Ps在NaCl處理時(shí)，表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，大部分AtABC1Ps受SA誘導(dǎo)，而OsAB

5、C1Ps則對(duì)SA沒有響應(yīng)。
　　 3、RT-PCR檢測了AtACDO1基因在擬南芥不同組織和器官中表達(dá)水平。結(jié)果表明該基因在擬南芥的根、莖、葉、花、角果等組織中均有表達(dá)，且葉片中表達(dá)最強(qiáng)。這與利用AtACDO1基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的研究結(jié)果相一致。AtACDO1-GFP轉(zhuǎn)化植物后提取原生質(zhì)體，用共聚焦激光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)AtACDO1定位于葉綠體。
　　 4、表型分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtACDO1敲減轉(zhuǎn)基因植株（At

6、ACDO1 RNAi）在正常培養(yǎng)條件下葉片泛黃，且葉片長度、寬度以及葉面積變小，但是單位面積葉片鮮重不變。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，AtACDO1 RNAi株系中葉綠素和類胡蘿卜素（新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素和β-胡蘿卜素）含量顯著低于野生型，且兩種色素者呈一定比例減少，但透射電鏡觀察葉綠體和線粒體超微結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)其在AtACDO1 RNAi株系與野生型有差異。NB-PAGE和蔗糖梯度離心分析光系統(tǒng)復(fù)合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AtACDO1 RNAi株系與野生

7、型中二者亦無明顯差異。
　　 5、不同的生長時(shí)期（10、20或30 d）、不同光強(qiáng)（10、40、80或120 μmolm-2s-1）以及不同光質(zhì)（白光、藍(lán)光、紅光以及遠(yuǎn)紅光）條件下，AtACDO1 RNAi植株中葉綠素含量均顯著低于野生型；且在生長第10 d、和20 d以及紅光下差異最為明顯。在黑暗誘導(dǎo)的衰老過程中，AtACDO1 RNAi植株中葉綠素含量顯著低于野生型，但AtACDO1敲減轉(zhuǎn)基因植株中葉綠素降解速度較野生型慢。

8、
　　 6、在不同光強(qiáng)下培養(yǎng)的擬南芥，AtACDO1 RNAi植株中類胡蘿卜素含量在光強(qiáng)為10 μmolm-1s-1時(shí)高于野生型，在其他光強(qiáng)下均低于野生型。
　　 7、AtACDO1 RNAi株系幼苗在去黃化過程中葉綠素的合成速度與野生型中無明顯差異，且在正常生長的植株葉片中葉綠素合成前體Pchlide與野生型間無差異
　　 8、AtACDO1 RNAi株系中，編碼葉綠素代謝酶的基因，包括HEMC、CHLH、CH

9、LD、DVR、PORA、PORB、PORC、CAO、LH1、CLH2、ACD1和ACD2以及類胡蘿卜素代謝基因ZDS和PDS在不同生長時(shí)期以及不同光強(qiáng)下的表達(dá)與野生型之間均不存在差異，但AtACDO1 RNAi株系中葉綠素酶活性顯著高于野生型，且積累降解產(chǎn)物Chlide和Pheide。
　　 9、在正常培養(yǎng)條件下AtACDO1 RNAi植株光合放氧速率顯著低于野生型，但光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)效率

10、ФPSⅡ、非光化學(xué)淬滅（NPQ）以及電子傳遞速率（ETR）與野生型之間沒有差異。在高光脅迫下FV/Fm低于卻低于野生型，但光系統(tǒng)Ⅱ恢復(fù)略快。
　　 10、非生物脅迫處理發(fā)現(xiàn)，在NaCl（120 mM）、甘露醇（300 mM）以及葡萄糖（300 mM）處理下，AtACDO1 RNAi株系萌發(fā)率與野生型之間沒有差異。在120 mM NaCl、120 mM KCl、100 mM KNO3、100 mMNaNO3以及15 μM CdCl

11、2條件下培養(yǎng)的AMCDO1 RNAi、Co1-0和35S：：AMCDO1株系幼苗中葉綠素含量均較正常條件下降低，尤以NaCl和KCl培養(yǎng)條件下最甚。氧化脅迫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常條件培養(yǎng)20d左右植株的葉片卻對(duì)氧化脅迫敏感，體內(nèi)積累更多H2O2；在連續(xù)高光（300 μmolm-2s-1）下培養(yǎng)7d的AtACDO1 RNAi植株葉片壞死情況較野生型嚴(yán)重，其葉片中花色素苷顯著低于野生型；且AtACDO1受MV誘導(dǎo)；敲減植株葉片對(duì)MV敏感，CSD1，