GDF-5在小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)軟骨分化過程中的實驗研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：研究GDF-5基因在不同孕期小鼠胚胎肢芽組織中的表達(dá)情況，了解其在肢體骨骼發(fā)育中的表達(dá)規(guī)律，初步闡明GDF-5基因在肢體發(fā)育過程中的作用。
　　 方法：選取清潔級2-3月齡昆明種小鼠30只，采用RT-PCR方法檢測不同胚齡肢芽組織GDF-5 mRNA的表達(dá)變化，采用Western blotting方法檢測不同胚齡肢芽組織GDF-5蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：①小鼠胚胎肢芽組織GDF-5mR

2、NA的表達(dá)規(guī)律：孕11.5到孕15.5天胚胎肢芽組織均可見一條219bp的GDF-5特異擴增條帶，即小鼠肢體骨骼發(fā)育的早期階段GDF-5mRNA持續(xù)表達(dá)，E11.5天肢芽組織剛剛形成時有少量表達(dá)，孕12.5和13.5天呈高表達(dá)，繼而表達(dá)減弱，孕12.5和13.5天GDF-5mRNA的相對含量與其余3天相比有極顯著性差異。②小鼠胚胎肢芽組織GDF-5蛋白的表達(dá)規(guī)律：GDF-5蛋白表達(dá)規(guī)律與mRNA變化趨勢相一致，孕11.5到孕15.5天胚

3、胎肢芽組織均觀察到分子量為13.7KDa的蛋白條帶孕12.5到孕13.5天GDF-5蛋白的相對含量高于其余3天，且有極顯著性差異.
　　 結(jié)論：GDF-5 mRNA和蛋白在小鼠肢體骨骼發(fā)育早期階段持續(xù)表達(dá)，孕12.5和13.5天呈高表達(dá)，繼而減弱，說明GDF-5是肢體骨骼發(fā)育早期的一個關(guān)鍵因子，提示GDF-5在體內(nèi)前軟骨細(xì)胞聚集、軟骨分化等過程中有很重要的作用
　　 第二部分
　　 目的：通過基因重組技術(shù)體外構(gòu)建

4、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/，并檢測其在小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 方法：根據(jù)Genbank中小鼠GDF-5序列設(shè)計并合成引物，提取孕14.5天小鼠胚胎肢芽組織總RNA，RT-PCR擴增，將擴增產(chǎn)物GDF-5基因片斷插入至pcDNA3.1(+)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定及測序；脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1(+)/ GDF-5重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染小鼠MSCs，細(xì)胞轉(zhuǎn)染分為三組：實驗組，用Lipof

5、ectamine TM2000進行pcDNA3.1(+)/GDF-5轉(zhuǎn)染；實驗對照組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)；空白對照組，加入等量脂質(zhì)體。然后采用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)方法分別檢測GDF-5 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：重組質(zhì)粒雙酶切圖譜顯示有5.4kbp和1.6kbp兩條帶，分別為pcDNA3.1(+)和GDF-5的片斷，表明GDF-5基因已經(jīng)成功的插入到pcDNA3.1(+)載體上；基因測序結(jié)果通過

6、BLAST程序分析顯示目的基因序列與Genbank公布的小鼠GDF-5序列完全相同；轉(zhuǎn)染后RT-PCR顯示實驗組有一219bp特異性擴增條帶，而實驗對照組和空白組均未出現(xiàn)條帶，提示有基因轉(zhuǎn)錄的發(fā)生；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)實驗組細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕色陽性染色，實驗對照組和空白組細(xì)胞胞漿內(nèi)無棕色染色，提示有GDF-5蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：本實驗成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中有GDF-5基

7、因的表達(dá)，體外進一步證實了GDF-5在肢體骨骼發(fā)育早期有很重要的作用。
　　 第三部分
　　 目的：研究GDF-5對小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)作用，探討的其成軟骨能力。
　　 方法：體外培養(yǎng)小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，貼壁細(xì)胞傳代，取第3代細(xì)胞，分5組進行誘導(dǎo)。培養(yǎng)14d后，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長變化；MTT法測定不同濃度GDF-5對小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響；RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測不同濃度GDF

8、-5對Ⅱ型膠原表達(dá)的影響；阿爾辛藍(lán)染色蛋白多糖。
　　 結(jié)果：倒置相差顯微鏡發(fā)現(xiàn)，B、C、D和E組MSCs由長梭形變?yōu)槎噙呅?，胞漿豐富，以D、E組最為明顯，并且出現(xiàn)細(xì)胞聚集形成的細(xì)胞小結(jié)，而A組細(xì)胞形狀變化不大，也無典型的細(xì)胞小結(jié)形成；MTT結(jié)果顯示B、C、D、E組與對照組A的平均吸光值相比，差異無顯著性意義，表明GDF-5誘導(dǎo)小鼠MSCs向軟骨分化的過程中對細(xì)胞的增殖沒有影響。RT-PCR結(jié)果顯示A組對照組無Ⅱ型膠原mRNA的

9、表達(dá)，B、C、D、E組均有表達(dá)，與β-actin光密度的比值分別為：B：0.384；C：0.423；D：0.638；E：0.865，B組到E組的Ⅱ型膠原的表達(dá)量依次增加，成劑量依賴關(guān)系；免疫細(xì)胞化學(xué)顯示A組對照組有個別細(xì)胞染色陽性，B、C組弱陽性，D、E組強陽性，表明GDF-5能夠促進MSC向軟骨細(xì)胞分化并分泌Ⅱ型膠原蛋白，成劑量依賴性；Alcian染色結(jié)果顯示A組對照組阿爾辛藍(lán)染色陰性，B、C組呈淡染，D、E組成藍(lán)色，并且可見細(xì)胞小結(jié)

10、區(qū)域呈明顯的異染性著色，表明GDF-5誘導(dǎo)細(xì)胞分泌蛋白多糖基質(zhì)。
　　 結(jié)論：GDF-5能夠體外定向誘導(dǎo)小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨方向分化并具有分泌軟骨細(xì)胞特異性Ⅱ型膠原和蛋白多糖基質(zhì)的功能，50-100ng/ml為最佳劑量，為進一步從細(xì)胞和分子水平明確其在軟骨分化機制中的作用奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　 第四部分
　　 目的：研究生長分化生長因子5在小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化過程中對縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的影響，探討

11、GDF-5在軟骨分化中的作用機制。
　　 方法：體外培養(yǎng)小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，貼壁細(xì)胞傳代，取第3代細(xì)胞，分兩組進行誘導(dǎo)：陰性對照組：培養(yǎng)液為無血清L-DMEM；實驗組：地塞米松(10-7M)、VitC(50μg/ml)、胰島素(6.25μg/ml)和GDF-5(100ng/ml)+對照組。在誘導(dǎo)24、48和72小時進行如下檢測：MTT法測定GDF-5對小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響；RT-PCR、Western blotting和

12、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測GDF-5對Cx43蛋白表達(dá)的影響。免疫細(xì)胞化學(xué)和阿爾辛藍(lán)染色分別檢測細(xì)胞誘導(dǎo)72小時軟骨細(xì)胞特異性Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示：不同時間點實驗組與對照組的平均吸光值相比，差異無顯著性意義，表明不同時間點GDF-5對小鼠MSCs增殖均沒有產(chǎn)生影響；RT-PCR結(jié)果表明不同時間點對照組Cx43的相對量變化不大，24、48、72 h實驗組Cx43的相對量與對照組相比有顯著性差異，GDF

13、-5誘導(dǎo)MSCs后Cx43 mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)；Western blotting結(jié)果表明Cx43蛋白的表達(dá)與mRNA變化趨勢大致相似，不同時間點實驗組Cx43蛋白表達(dá)的相對量與對照組相比有顯著性差異；Cx43蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明對照組細(xì)胞均為陽性，但是陽性細(xì)胞數(shù)變化不大，不同時間點實驗組陽性細(xì)胞率與對照組相比有顯著性差異。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明實驗組呈陽性，對照組陰性，說明有軟骨細(xì)胞特異性Ⅱ型膠原的表達(dá)；阿爾辛藍(lán)染色結(jié)

14、果表明實驗組細(xì)胞阿爾辛藍(lán)染色陽性，呈藍(lán)色，對照組則無明顯的異染性著色，說明GDF-5誘導(dǎo)小鼠MSCs分泌出軟骨特異性蛋白多糖。
　　 結(jié)論：GDF-5可以在誘導(dǎo)早期通過上調(diào)縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)來促進小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化，這也提示GDF-5在體外軟骨誘導(dǎo)中的機制包括了Cx43介導(dǎo)的縫隙連接細(xì)胞間通訊途徑。
　　 第五部分
　　 目的：研究縫隙連接阻斷劑1-庚醇在GDF-5體外誘導(dǎo)小鼠骨髓基質(zhì)干

15、細(xì)胞軟骨分化中的作用，進一步探討GDF-5在軟骨分化中的作用機制。
　　 方法：體外培養(yǎng)小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，貼壁細(xì)胞傳代，取第3代細(xì)胞，分3組進行誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)72小時進行如下檢測：RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測Ⅱ型膠原的表達(dá)；Western blotting檢測Cx43蛋白的表達(dá)；阿爾辛藍(lán)染色蛋白多糖。MTT法測定1-庚醇對小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示24、48、72h實驗組與對照組的

16、平均吸光值相比，差異無顯著性意義，說明2.5μmol/L濃度1-庚醇對MSCs細(xì)胞增殖不產(chǎn)生影響，對細(xì)胞沒有毒性抑制作用；RT-PCR結(jié)果顯示對照組無Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)，GDF-5和GDF-5+1-庚醇組則均有表達(dá)，與β-actin光密度的比值分別為：0.527±0.013；0.386±0.008。GDF-5和GDF-5+1-庚醇組Ⅱ型膠原mRNA的相對量比差異有顯著性意義；Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示對照組染色陰性，GDF-5

17、組強陽性，GDF-5+1-庚醇組陽性，這均表明1-庚醇能夠抑制GDF-5誘導(dǎo)MSC向軟骨方向的分化。Alcian染色結(jié)果顯示對照組陰性，GDF-5組呈廣泛的藍(lán)染，GDF-5+1-庚醇組染色較GDF-5組明顯減弱，但仍成藍(lán)色，說明1-庚醇能夠抑制蛋白多糖的分泌。Western blotting結(jié)果表明Cx43蛋白相對量分別為：對照組 0.326±0.004；GDF-5組 0.582±0.006；GDF-5+1-庚醇組 0.576±0.01