脂肪基質(zhì)細胞誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細胞過程中線粒體凋亡與自噬的關(guān)系.pdf

1、目的：探討在ADSCs誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細胞過程中線粒體凋亡與自噬的關(guān)系，從而為進一步增加獲得的ADSCs源性星形膠質(zhì)細胞數(shù)量并延長其存活時間具有重要的科學意義。
　　方法：1、參照葉長青等的實驗方法，將成人脂肪組織體外分離、培養(yǎng)為 ADSCs，倒置相差顯微鏡下每日觀察 ADSCs的形態(tài)學變化。2、將傳至第3代的成人 ADSCs，應(yīng)用以含 IBMX為主要成分的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)其向星形膠質(zhì)細胞分化，按照誘導(dǎo)時間的不同分為誘導(dǎo)48h、7d、

2、14d、21d組，并在倒置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細胞形態(tài)學的變化。3、應(yīng)用免疫細胞化學法和Western-blotting分別檢測未誘導(dǎo)的ADSCs及誘導(dǎo)分化48h、7d、14d、21d的星形膠質(zhì)細胞特異性標志蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein, GFAP），Bcl-2蛋白家族蛋白Bcl-2、Bax及細胞色素C（Cytochrome C）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Cystein

3、e aspartate specific protease-3）及微管相關(guān)蛋白輕鏈3（Microtubule-associated protein light chain3, LC3）的表達。4、流式細胞術(shù) Annexin/PI雙染法檢測未誘導(dǎo)的ADSCs及誘導(dǎo)后48h、7d、14d、21d時細胞的生存狀態(tài)。5、透射電子顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后14d的星形膠質(zhì)細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)、凋亡及自噬現(xiàn)象。6、MTT法檢測 ADSCs誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細

4、胞過程中細胞的生長狀態(tài)。7、統(tǒng)計學方法：所得實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用 Excel2003數(shù)據(jù)庫整理，采用統(tǒng)計軟件包 SPSS17.0進行分析，數(shù)據(jù)均以（(x)±s）表示，不同時間點間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：1、提取的原代 ADSCs于24h時已貼壁，倒置相差顯微鏡下可見細胞呈三角形、短梭形。培養(yǎng)至7~10d時可見大量呈漩渦狀排列的長梭形細胞。2、誘導(dǎo)反應(yīng)48h時，細胞折光性增強，部分細胞的胞體周

5、圍伸出細長突起，并有多個分支。誘導(dǎo)反應(yīng)7d時，細胞胞體折光性顯著增強，部分細胞呈現(xiàn)典型的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)，并交織成網(wǎng)狀。誘導(dǎo)14d時，細胞胞體折光性較7d時更加增強，但細胞形態(tài)與7d時無明顯變化。誘導(dǎo)21d時，細胞數(shù)量減少，細胞的突起較誘導(dǎo)14d時變短、變少。3、免疫細胞化學結(jié)果顯示GFAP在未誘導(dǎo)的ADSCs中無陽性表達，而在誘導(dǎo)后各時間點均可見陽性表達細胞，且在細胞體和突起部位的細胞質(zhì)均呈陽性表達，GFAP的細胞陽性表達率僅7d與1

6、4d無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），至誘導(dǎo)7d時GFAP的陽性表達率達到高峰（P＜0.05）。Bax、Bcl-2、Cyt-c、Caspase-3和LC3在未誘導(dǎo)的ADSCs和誘導(dǎo)反應(yīng)的各時間點均可見陽性表達，而且陽性表達部位主要位于細胞核周圍的細胞漿，而突起部位沒有見到明顯的陽性表達。Bcl-2的陽性表達率隨著誘導(dǎo)時間的延長逐漸降低（P＜0.05），在未誘導(dǎo)的ADSCs和誘導(dǎo)后各時間點僅7d與14d無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。Bax、C

7、yt-c、Caspase-3、LC3的陽性表達率在未誘導(dǎo)的ADSCs和誘導(dǎo)后48h、7d、14d、21d之間均有明顯統(tǒng)計學差異（P均＜0.01），至誘導(dǎo)14d時 Bax、Cyt-c、Caspase-3、LC3的陽性表達率均達到高峰（P均＜0.05）。4、Western-blotting結(jié)果顯示，GFAP在未誘導(dǎo)組的ADSCs中無表達，隨誘導(dǎo)時間的延長其表達量增加，至7d時達到高峰（P＜0.05）。Bcl-2的表達水平隨著誘導(dǎo)時間的延長逐

8、漸降低（P＜0.05）。LC3Ⅰ的表達隨誘導(dǎo)時間的延長，逐漸降低（P＜0.05）。Bax、Cyt-c、Caspase-3及LC3Ⅱ的表達水平均逐漸增加，至誘導(dǎo)14d達到高峰（P均＜0.05）。5、透射電子顯微鏡下可見到線粒體的超微結(jié)構(gòu)，凋亡小體結(jié)構(gòu)及自噬現(xiàn)象。6、流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)反應(yīng)過程中的細胞存活率隨著誘導(dǎo)時間的延長逐漸下降，早期凋亡率、晚期凋亡或壞死率隨著誘導(dǎo)時間的延長逐漸升高。7、MTT的結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時間的延長

9、，細胞的存活數(shù)量逐漸下降。
　　結(jié)論：1、ADSCs在應(yīng)用以IBMX為主要成分的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細胞的第7~14d時處于最佳的存活和分化狀態(tài)，此時可以終止反應(yīng)，并對于所得的細胞進行篩選分離和保存，以便于進行相關(guān)的應(yīng)用和研究。2、在正常 ADSCs中，經(jīng)線粒體信號傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生的凋亡和自噬反應(yīng)較弱。3、在ADSCs誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細胞的過程中，線粒體凋亡和細胞自噬反應(yīng)明顯增強，但自噬反應(yīng)不足以清除全部受損的線粒體，從而引發(fā)線