HBV X-DNA-早期檢測(cè)拉米夫定治療中耐藥性發(fā)展的血清標(biāo)志物.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是一個(gè)全球性的公共健康問題。我國(guó)是HBV感染的高發(fā)區(qū)，在全世界3.5億無癥狀HBV攜帶者(chronic asymptomatic HBV carrier,AsC)中，中國(guó)占1.3億，慢性乙型肝炎患者2800萬。HBVDNA有4個(gè)重疊的開放式閱讀框架（Open Reading Frame,ORF），即：PreC/C、多聚酶、PreS1/PreS2/S和X基因，其可被轉(zhuǎn)錄

2、到基因組和前基因組RNA分子中。其中最小的病毒轉(zhuǎn)錄體HBx翻譯產(chǎn)物被認(rèn)為是肝癌的致癌因子，HBx的特性包括刺激轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、干擾DNA修復(fù)、誘導(dǎo)凋亡、促進(jìn)體內(nèi)體外的惡性轉(zhuǎn)化。在HBV復(fù)制期間，在HBxORF產(chǎn)生兩種病毒轉(zhuǎn)錄體，即：全長(zhǎng)型轉(zhuǎn)錄體（Full-length RNA，fRNA），Poly(A)信號(hào)成熟位于（1789位）UAUAAA結(jié)構(gòu)區(qū)；及頓挫型轉(zhuǎn)錄體（Truncated RNA trRNA），成熟的Poly(A)信號(hào)位于（1

3、661位）CAUAAA結(jié)構(gòu)區(qū)。后者隱藏于HBx基因ORF內(nèi)，只有當(dāng)fRNA成熟信號(hào)被滅活時(shí)，trRNA成熟信號(hào)才具有活性。1996年Schutz等建立用于檢測(cè)肝組織內(nèi)HBV轉(zhuǎn)錄體的方法；2001年以來，Su和Zhang等先后建立了從血清中檢測(cè)這兩種轉(zhuǎn)錄體的定性和定量檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于血清HBV核酸研究結(jié)果表明，短期拉米夫定治療慢性感染患者引起阻斷于負(fù)鏈合成早期的復(fù)制早期中間體的快速波動(dòng)。相反，病毒mRNA的形成卻基本未受影響。在

4、此，我們對(duì)兩名經(jīng)長(zhǎng)期拉米夫定干預(yù)治療的患者進(jìn)行研究，探討無明顯復(fù)制期HBV血清核酸標(biāo)志物。
　　方法：自兩名HBV表面抗原(HBsAg)和E抗原（HBeAg）陽(yáng)性、經(jīng)長(zhǎng)期拉米夫定干預(yù)治療的HBV慢性感染患者血清中提取核酸，采用本實(shí)驗(yàn)已建立的方法，經(jīng)PCR定量HBVX區(qū)、C區(qū)、preC區(qū)DNA及相應(yīng)的RNA，將全長(zhǎng)型RNA(FulllengthRNA,fRNA)和頓挫型RNA（Truncated RNA,trRNA）作為poly(A

5、)RNA測(cè)定，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果，Southern-blotting驗(yàn)證反應(yīng)的特異性。
　　結(jié)果：患者1的病毒DNA分別在12個(gè)月（XDNA）、9個(gè)月（CDNA）、8個(gè)月（PreCDNA）內(nèi)從109·mL-1下降為103·mL-1。各自RNA片段的減少也表現(xiàn)為相似的動(dòng)力學(xué)。然而在早期的時(shí)間點(diǎn)，RNA的拷貝數(shù)要比相應(yīng)的DNA低（106－107）。在第6個(gè)月，患者1被檢測(cè)出形成YVDD突變。在第16、17和18個(gè)月

6、，僅見X區(qū)DNA和RNA早期反跳和連續(xù)性下降。從第19，20，21個(gè)月開始，X，C和PreCDNA各自表現(xiàn)為穩(wěn)步增長(zhǎng)。相應(yīng)的X，C和PreCRNA片段的拷貝數(shù)也遵循類似的模式，卻未達(dá)到各自DNA片段的水平。也就是說，它們沒有達(dá)到開始拉米夫定治療時(shí)的水平。檢測(cè)Poly(A)RNA（即fRNA和trRNA）來測(cè)定病毒DNA的轉(zhuǎn)錄活性，全長(zhǎng)型RNA的消失和反跳與所觀察到的DNA片段類似。與fRNA相比，頓挫型RNA持續(xù)時(shí)間更為長(zhǎng)久，且其更早再

7、現(xiàn)。肝損傷標(biāo)志物ALT和AST的模式與病毒核酸的消失與重現(xiàn)平行。
　　患者2未出現(xiàn)YMDD突變。鑒于6個(gè)月未查到病毒復(fù)制標(biāo)志物，在對(duì)其進(jìn)行拉米夫定治療20個(gè)月后停藥。在第24個(gè)月，由于ALT/AST重新上升，為改善肝功能[121]，對(duì)其采用混合中草藥提取物治療。由于HBeAg在第27個(gè)月重新出現(xiàn)，采用中草藥＋干擾素2α到第30個(gè)月，未見明顯效果。因此，重新對(duì)其開始拉米夫定治療，并被證明有效?；颊?的DNA和RNA與患者1有相似的表

8、現(xiàn)。在病毒復(fù)制反跳期間，trRNA較fRNA存在更久、且出現(xiàn)更早。與患者1類似，其HBeAg與ALT/AST同病毒復(fù)制平行。
　　證實(shí)了阻斷早期中間體的優(yōu)先形成。由于出現(xiàn)抗藥性突變（患者1）和不連續(xù)的治療（患者2），兩名患者均可見到病毒復(fù)制迅速反跳。fRNA隨PreCDNA、trRNA隨XDNA水平變化，在治療后期的某些時(shí)間點(diǎn)，trRNA是唯一出現(xiàn)的poly(A)病毒RNA。
　　結(jié)論：HBVX-DNA是早期檢測(cè)拉米夫定治療