MAPC-EPC性組織工程化靜脈瓣的安全性評價.pdf

1、原發(fā)性瓣膜功能不全、血栓形成完全再通后的瓣膜破壞以及先天性瓣膜缺乏等靜脈疾患，靜脈瓣移植常常是最后的選擇。鑒于自體靜脈瓣移植來源有限、損傷較大、瓣膜強度不足和管徑難以匹配等問題，組織工程化靜脈瓣是修復(fù)與重建靜脈瓣膜結(jié)構(gòu)、功能的理想方案。本室構(gòu)建的MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣在犬及綿羊體內(nèi)移植，取得了較為理想的結(jié)果，然而，評判一種組織工程化組織或器官是否具有臨床應(yīng)用前景，還必需進行安全性的檢測。本研究參照醫(yī)療器械IS010993系列

2、標準，對異種脫細胞靜脈瓣支架材料和體外構(gòu)建的MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣進行了體外毒性試驗、血液相互作用試驗、植入后局部反應(yīng)試驗和免疫性評價的研究，證明，MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣可較安全地應(yīng)用于人體。
　　 原發(fā)性瓣膜功能不全、血栓形成完全再通后的瓣膜破壞以及先天性瓣膜缺乏等靜脈疾患，靜脈瓣移植常常是最后的選擇。但是，自體靜脈瓣移植除來源有限、損傷較大外，尚有瓣膜強度不足和帶瓣靜脈的管徑往往難以符合要求等問題。近

3、年來，心血管組織工程技術(shù)的發(fā)展為構(gòu)建組織工程化靜脈瓣膜提供了可能。研究證明，雖然每條深靜脈的瓣膜有多對，但只要移植一對有功能的瓣膜就能明顯改善血液逆流的問題，這就使得構(gòu)建組織工程化靜脈瓣更具有實用價值。因此應(yīng)用細胞生物學(xué)與工程學(xué)原理開發(fā)出具有生物活性、無免疫原性的組織工程化靜脈瓣是修復(fù)與功能重建深靜脈功能不全的理想方案。
　　 本實驗室利用生物學(xué)及工程學(xué)原理，以自體骨髓分離、培養(yǎng)的EPC(endothelialprogenito

4、r cells，EPC)和MAPC(multipotent adult progenitor cells，MAPC)作為種子細胞，以異種脫細胞靜脈瓣作為支架材料，構(gòu)建的MAPC/EPC組織工程化靜脈瓣，在犬及綿羊體內(nèi)對其效用性研究已經(jīng)取得了較為理想的結(jié)果，具有良好的臨床應(yīng)用前景。然而，評判一種組織工程化組織或器官是否具有臨床應(yīng)用前景，除證明其有效性外，安全性的評價至關(guān)重要。
　　 組織工程化組織或器官的構(gòu)成，具有3個基本要素：支

5、架材料(相當于細胞外基質(zhì)，ECM)、種子細胞(培養(yǎng)、增殖形成組織或器官的細胞)和生長因子(有助于種子細胞的增殖)。根據(jù)組織工程化產(chǎn)品安全性評價的慣例，需要對這3個要素及其相互作用的安全性進行評價。
　　 目前，國際上對組織工程產(chǎn)品還沒有整體的管理規(guī)定和評價方法。美國食品藥物管理局(FDA)是最早進行組織工程醫(yī)療產(chǎn)品安全性評價和監(jiān)督管理的機構(gòu)，1994年組建了FDA組織工程工作組(TEWG)，主要是參照醫(yī)療器械的管理進行組織工程醫(yī)

6、療產(chǎn)品的安全性評價和監(jiān)督管理工作，但目前僅有組織工程化皮膚、軟骨、一些支架材料的完整評價標準。我國組織工程化產(chǎn)品的安全性評價工作剛剛起步，不同組織工程化組織、器官安全性評價的參數(shù)選擇和實施方法正在制定之中。
　　 本項目采用的種子細胞來源于試驗動物自身，培養(yǎng)過程中沒有進行基因改造，按照我國《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品標準》起草專家委員會的初步共識，其安全性評價暫不作硬性要求。對純天然的支架材料及以純天然材料為支架構(gòu)建的組織工程化產(chǎn)品，根據(jù)

7、慣例，遺傳毒性試驗暫不作硬性要求。因此，本研究參照醫(yī)療器械IS010993系列標準，僅對異種脫細胞靜脈瓣支架材料和體外構(gòu)建的MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣進行了體外毒性試驗、血液相互作用試驗、植入后局部反應(yīng)試驗和免疫性評價的研究。
　　 第一部分異種脫細胞靜脈瓣支架材料的安全性評價
　　 研究目的：制備異種脫細胞靜脈瓣支架，為體外構(gòu)建組織工程化靜脈瓣提供支架材料，評價其作為組織工程支架材料的安全性。
　　 研

8、究方法：取正常成年綿羊(雌性不限)股靜脈40條，修剪為2 cm左右的段，確保每段保留一對靜脈瓣。首先采用0.5％TritonⅩ-100+0.05％NH40H振搖(4℃)處理3天，然后超純水振搖(4C)漂洗3天，再換用DNase+RNase(37(℃)作用12 h，超純水漂洗2 h，完全去除股靜脈壁及瓣膜中的細胞成分，將得到的脫細胞細胞外基質(zhì)材料置Eppendorf管中，封口膜密封，60C0輻照滅菌，-80℃保存，即得到異體脫細胞靜脈瓣支

9、架。將異種脫細胞靜脈瓣支架分別進行以下的試驗：體外細胞毒性試驗；血液相容性試驗；植入后局部反應(yīng)試驗；免疫學(xué)試驗。
　　 結(jié)果：異體脫細胞靜脈瓣支架外形完整，H-E染色未見到細胞成分，纖維連續(xù)無斷裂。HLA-1免疫組化染色為陰性，說明免疫原性極弱。體外細胞毒性試驗顯示種子細胞和支架材料組織相容性好；血液相容性試驗中，體外實驗顯示脫細胞支架材料不會引起紅細胞溶解，體內(nèi)實驗顯示局部有血栓形成；植入體內(nèi)后局部反應(yīng)試驗顯示早期局部炎性反應(yīng)

10、，隨著時間延長，支架周圍細胞逐漸減少；免疫學(xué)試驗顯示：脫細胞支架材料浸提液不會引起體外淋巴細胞增殖，植入體內(nèi)后BALB/C小鼠血清中IgG水平無明顯升高。
　　 結(jié)論：脫細胞支架材料形態(tài)特征符合支架材料的條件；與種子細胞組織相容性好；體內(nèi)血液相容性實驗雖然局部有血栓形成，應(yīng)該與支架材料沒有內(nèi)皮化有關(guān)；局部植入后無免疫排斥反應(yīng)；免疫原性低；可以作為構(gòu)建組織工程化靜脈瓣的支架材料。
　　 第二部分 MAPC/EPC性組織工程

11、化靜脈瓣的安全性評價
　　 研究目的：體外構(gòu)建MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣，評價其安全性。
　　 研究方法：以實驗動物自體EPC和MAPC作為種子細胞，異種脫細胞帶瓣靜脈作為支架，采用多點注射和加壓灌注將MAPC和EPC種植到異體脫細胞靜脈瓣支架壁內(nèi)和內(nèi)表面，體外培養(yǎng)2周，構(gòu)建MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣；取出細胞-支架材料復(fù)合物，分別進行體外血液相容性試驗、植入新西蘭白兔下腔靜脈體內(nèi)血液相容性試驗、BALB

12、/C小鼠皮下植入試驗；以及免疫學(xué)試驗。
　　 結(jié)果：體外復(fù)合培養(yǎng)2周后，H-E染色見EPC完整覆蓋支架內(nèi)表面，MAPC能夠生長至支架內(nèi)部，生長狀況良好。血液相容性試驗中，體外實驗顯示細胞-支架材料復(fù)合物不引起紅細胞溶解，植入體內(nèi)后局部血流通暢，無血栓形成；局部植入后無免疫排斥反應(yīng)；免疫學(xué)試驗見免疫原性低。
　　 結(jié)論：以自體EPC和MAPC為種子細胞、異種脫細胞帶瓣靜脈為支架材料，構(gòu)建的MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣