MAPC-EPC性組織工程化靜脈瓣.pdf

1、采用生物學及工程學原理構建組織工程化靜脈瓣有望能治愈下肢慢性靜脈功能不全,具有良好的臨床應用前景。本文將受體Beagle犬骨髓來源的成體多能祖細胞(multipotent adult progenitor cells,MAPC)和內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPC)作為種子細胞,采用同種異體脫細胞靜脈瓣細胞外基質材料作為支架,利用多點注射、加壓灌注的方法將MAPC種植到支架內部,然后應用血管自動

2、旋轉脈動系統(tǒng),使EPC黏附于支架的內表面及瓣膜的竇腔兩面,即得到"MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣”；并對其形態(tài)結構、生物力學特性做了進一步研究。然后采用端端吻合術將構建的組織工程化靜脈瓣吻接到受體犬頸外靜脈,觀察其體內過程。本文包括五部分內容:MAPC的分離、培養(yǎng)及鑒定；EPC的分離、培養(yǎng)及鑒定；同種異體脫細胞靜脈瓣支架的制備；MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣體外構建；組織工程化靜脈瓣的在體研究。 針對這些問題,本項目采用

3、同種異體脫細胞Beagle犬靜脈瓣作為支架,聯(lián)合應用多點注射、加壓灌注等技術,分別種植成體多能祖細胞(Multipotent adult progenitorcells,MAPC)和內皮祖細胞(Endothelial progenitor cells,EPC),體外構建組織工程化靜脈瓣,稱之為"MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣”；并將其吻接于受體Beagle犬頸外靜脈,觀察在體情況,同時進行效用性研究,以研制一種應用于治療慢性靜脈功能

4、不全的組織工程化靜脈瓣。 第一部分 MAPC的分離、培養(yǎng)、鑒定及誘導分化研究 目的：探討成體犬骨髓MAPC的體外培養(yǎng)條件、生物學特性及其向平滑肌樣細胞分化的可能性。 研究方法：無菌條件下抽取受體Beagle犬髂骨骨髓10ml,采用MAPC特異的擴增培養(yǎng)基體外培養(yǎng)全部骨髓。細胞傳代至第4代,對所有貼壁生長細胞進行免疫微珠分選,采用CD45抗體,收集CD45-細胞即MAPC另瓶培養(yǎng)(MAPC特異擴增培養(yǎng)基)。于不同時

5、間觀察MAPC的形態(tài)、生長情況,檢測其表面標志；利用流式細胞技術檢測MAPC的生長周期及特異表面標志表達率；并以分化培養(yǎng)基誘導培養(yǎng),采用RT-PCR方法檢測MAPC OCT-4基因及分化細胞SM-MHC(smooth muscle cells-myosin heavy chain)基因表達；同時檢測平滑肌細胞表面標志在分化細胞的表達。 結果：光鏡下觀察犬骨髓MAPC體積偏大,長多角型,數(shù)個細長偽足,細胞核大,細胞質豐富,細胞增殖

6、能力旺盛；表達表面標志CDl3和SSEA-1,不表達CD44、CD45、CD133和MHCII;RT PCR結果顯示MAPC表達OCT-4。誘導分化后,分化細胞表達平滑肌細胞表面標志--α-SMA、calponin、SM-MHC;RT PCR結果顯示分化細胞表達SM-MHC。 結論:MAPC增殖擴增能力強、生物特性穩(wěn)定、易于向平滑肌樣細胞分化,是心血管組織工程和干細胞移植較為理想的種子細胞。 第二部分 EPC的分離、培養(yǎng)

7、、鑒定及誘導分化研究 目的：探討成體犬骨髓EPC的體外培養(yǎng)條件、生物學特性及其向內皮細胞(Endothelial cells,EC)分化的能力。 研究方法：無菌條件下抽取受體Beagle犬髂骨骨髓10ml,采用EGM-MV2培養(yǎng)基體外培養(yǎng)全部骨髓。細胞傳代至第4代,對所有貼壁生長細胞進行免疫微珠分選,采用CD14抗體,收集CD14+細胞即EPC另瓶培養(yǎng)(EGM-MV2培養(yǎng)基)。于不同時間觀察EPC的形態(tài)、生長情況,檢測其

8、表面標志；利用流式細胞技術檢測EPC的生長周期及特異表面標志表達率；將生長至18代的貼壁細胞以分化培養(yǎng)基(M199+20％胎牛血清+VEGF)誘導培養(yǎng)；采用RT-PCR方法檢測EPC和分化細胞eNOS、KDR和VE-cadherin基因表達。同時采用免疫熒光檢測分化細胞內皮表面標志的表達。 結果：早期EPC為分選后8代之前的EPC,體積略小,類圓形,60％融合時呈串珠樣排列,表達CD133、CD14;晚期EPC由表達VE-cad

9、herin、KDR、CD14的早期EPC分化而來,形態(tài)為多邊形,分泌活動明顯加強,表達CD133、VE-cadherin、CD14和KDR;誘導分化細胞呈鵝卵石樣外觀,表達VⅢ因子、CD31。 結論：骨髓EPC隨培養(yǎng)時間呈現(xiàn)不同生物學特性,早期EPC不穩(wěn)定,晚期EPC生物學特性穩(wěn)定、增殖能力強、分化為EC的比率高,是血管組織工程學研究良好的種子細胞。 第三部分 同種異體脫細胞靜脈瓣支架的制備研究 目的：希望找到一

10、種較為理想的制備脫細胞細胞外基質材料的方法,獲得較為理想的同種異體脫細胞靜脈瓣支架,為體外構建組織工程化靜脈瓣提供支架材料,并探討相應的技術方法。 研究方法：取正常成年Beagle犬(雌雄不限)股靜脈40條,修剪為2 cm左右的段,確保每段保留一對靜脈瓣,首先采用0.5％Triton X-100+0.05％NH4OH振搖(4℃)處理3天,然后超純水振搖(4℃)漂洗3天,再換用DNase+RNase(37℃)作用12 h,超純水漂

11、洗2 h,完全去除股靜脈壁及瓣膜中的細胞成分,將得到的脫細胞細胞外基質材料置Eppendorf管中,封口膜密封,60CO輻照滅菌,-80℃保存,即得到同種異體脫細胞靜脈瓣支架。部分支架進行組織學、形態(tài)學及力學檢測。 結果：大體觀察見脫細胞靜脈瓣支架外形完整,乳白色,H-E染色未見到細胞成分,纖維連續(xù)無斷裂。HLA-1免疫組化染色為陰性,說明免疫原性極弱。掃描電鏡顯示支架孔隙大小不均,未見到細胞,膠原纖維排列整齊、連續(xù),未見斷裂。

12、力學檢測顯示最大斷裂強度與正常靜脈瓣相比無明顯差異。 結論：脫細胞靜脈瓣支架形態(tài)特征、力學特性符合生物支架的條件,無免疫原性,可以作為構建組織工程化靜脈瓣的支架材料。 第四部分 MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣的構建研究 目的：構建MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣,從細胞與支架的復合程度、細胞在支架中的生長狀態(tài)及機械性能等方面評價其性能。 研究方法：免疫微珠體外分離得到的犬骨髓MAPC和EPC作為種子

13、細胞,同種異體脫細胞帶瓣靜脈作為支架,采用多點注射和加壓灌注將受體犬MAPC和EPC種植到同種異體脫細胞靜脈瓣支架壁內、靜脈壁內表面及瓣膜竇腔兩面,體外培養(yǎng)2周；取出復合培養(yǎng)物,制作石蠟切片,H-E染色及膠原纖維、彈性纖維染色檢測；掃描電鏡檢測其表面內皮化程度；透射電鏡檢測內部MAPC生長情況；機械力學檢測構建靜脈瓣的彈性回復率及最大斷裂強度。 結果：體外復合培養(yǎng)2周后,H-E染色見MAPC能夠生長至支架內部,連成片,分布較均勻

14、,分泌細胞外基質；掃描電鏡檢測EPC完整覆蓋支架內表面,靜脈瓣竇腔兩面均完成了內皮化；透射電鏡結果顯示MAPC長入支架壁內部,生長狀況良好. 結論：體外構建的MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣,結構及力學特性與正常瓣膜相似,種子細胞在其內部生長均勻,表面再內皮化完全,可以作為靜脈瓣移植物進行體內實驗。 第五部分 MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣的體內研究研究 目的：觀察MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣植入受體

15、犬體內后,功能發(fā)揮和形態(tài)結構的變化。 研究方法：雌性1 y齡Beagle犬12只,分3組,每組4只。將構建的MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣以端端吻合術吻接至受體犬左側頸外靜脈。右側作為對照組,植入同種異體脫細胞靜脈瓣支架。術后1、3、6個月彩色超聲多普勒檢查,小動物超聲檢查及數(shù)字減影血管造影(DSA)后處死實驗犬,取出移植物,大體觀察后,4％多聚甲醛固定,脫水、透明、石蠟包埋,制備石蠟切片,進行H-E染色及免疫組織化學染色。

16、 結果:MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣植入體內后活體檢查：術后彩色超聲多普勒檢查顯示通暢率實驗組(對照組)分別為1個月4/4(4/4),3個月4/4(2/4),6個月4/4(1/4);術后3個月DSA檢查實驗組未見返流,對照組可見明顯返流；術后6個月小動物超聲檢查實驗組可見瓣膜回聲,但是瓣膜運動受限,對照組靜脈壁增厚,瓣膜形態(tài)分辨不清。大體、組織學及免疫組織化學觀察：術后1個月實驗組未見血栓形成,靜脈壁及瓣膜壁無明顯增厚,形

17、態(tài)與正常相似,內皮處及瓣膜CD106陽性,中膜α-actin及Desmin陽性；對照組出現(xiàn)肉眼可見血栓,H-E染色為瓣膜處較大附壁血栓,內膜除表達CD106外,α-actin及Desmin也明顯表達；術后3個月實驗組瓣膜處見附壁血栓,但是靜脈壁無明顯增厚,瓣膜形態(tài)清晰可辨,內膜CD106陽性,中膜α-actin及Desmin陽性；對照組瓣膜明顯增厚似靜脈壁,不能分清靜脈壁三層結構,內膜處、瓣膜及靜脈壁均表達α-actin和Desmin,