肺泡巨噬細胞在過敏性哮喘中發(fā)揮作用的初步研究.pdf

1、目的：
　　以雞卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)與免疫佐劑明礬(Aluminium hydroxide，ALUM)來腹腔致敏小鼠，并聯(lián)合OVA霧化誘導小鼠過敏性哮喘，研究肺臟中肺泡巨噬細胞(AM)在過敏性哮喘中發(fā)揮的作用。
　　以C57BL/6小鼠及相關(guān)轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠為實驗動物，建立小鼠哮喘模型，主要以CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因的嵌合小鼠氣管內(nèi)注射白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)清除肺臟中的肺泡巨

2、噬細胞(AM)與樹突狀細胞亞群(DCs)，來研究肺臟中肺泡巨噬細胞在過敏性哮喘中的作用機制。本論文目前主要以細胞與分子免疫學、免疫熒光及免疫組織化學方法為核心技術(shù)，研究在過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展過程中，天然免疫水平上肺中AM與DCs的變化，以及肺臟中AM與DCs對獲得性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)性功能的變化，以明確其可能的作用機制。為探索過敏性哮喘等呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)病機制、研制預防、治療過敏的藥物及方法提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　首先

3、，選用雌性6-8周的C57BL/6小鼠，以免疫佐劑明礬（alum）混加入雞卵清蛋白(OVA)，震蕩混勻充分乳化OVA后，對小鼠腹腔注射做初次致敏免疫，14天后再次相同劑量進行第二次致敏免疫。在第二次腹腔致敏后，用OVA在28-30連續(xù)霧化3天，每次30min，建立小鼠過敏性哮喘模型。
　　其次，聯(lián)合應(yīng)用相關(guān)轉(zhuǎn)基因和基因敲除純合小鼠及其嵌合小鼠建立哮喘模型。對CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠頸椎脫臼處死，取其骨髓制單細胞懸液，尾靜脈回輸

4、到輻照后的相應(yīng)小鼠，制造CD11c-DTR嵌合鼠，并且8周后檢測嵌合情況，建立CD11c-DTR嵌合小鼠過敏性哮喘模型。
　　最后，各組小鼠最后一次霧化24小時后，摘眼球取血，頸椎脫臼處死，取支氣管肺泡灌洗液、肺臟、肺引流淋巴結(jié)、脾臟等;以ELISA的方法檢測血清和灌洗液中IL4、IgG1、IgG2b等的表達水平;以Real-time PCR檢測肺組織及其引流淋巴結(jié)中細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達水平;以FACS AriaⅡ的含9色流式

5、細胞儀檢測相關(guān)的樹突狀細胞亞群(DCs)、肺泡巨噬細胞（AM）、淋巴細胞亞群及其相關(guān)的胞內(nèi)細胞因子的表達水平;對肺部組織切片進行HE、PAS，觀察肺部組織形態(tài)、肺部變應(yīng)性炎癥反應(yīng)狀態(tài)的變化情況。
　　結(jié)果：
　　C57BL/6小鼠哮喘模型，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)支氣管肺灌洗液以及肺部單細胞懸液的嗜酸性粒細胞數(shù)所占比例，OVA+ALUM組＞PBS組。AM、DC所占比例，均呈OVA+ALUM組＞PBS組。肺部切片HE/PAS染色，O

6、VA+ALUM組較PBS組肺部呼吸道周圍炎癥細胞募集浸潤程度以及氣道粘液分泌程度要嚴重。ELISA檢測血清發(fā)現(xiàn)IgG1的表達OVA+ALUM組＞PBS組，而IgG2b無差異。從而證明OVA+ALUM腹腔致敏并且OVA霧化組肺部炎癥狀態(tài)較為嚴重，明顯高于PBS陰性對照組。CD103+CD11b-DCs在過敏原激發(fā)后的肺部會大量募集，且CD4+T大量增殖。
　　CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因嵌合小鼠氣管內(nèi)注射白喉毒素(DT)效果相對穩(wěn)定，注

7、射DT后，主要清除CD103+DC亞群和肺泡巨噬細胞。進一步研究DC和肺泡巨噬細胞清除后的回歸規(guī)律發(fā)現(xiàn)DC比AM早約4天回歸。
　　CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因嵌合小鼠哮喘模型，氣管內(nèi)注射DT組，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)支氣管肺灌洗液以及肺部單細胞懸液的嗜酸性粒細胞數(shù)所占比例較OVA+ALUM組明顯下降，肺部切片HE/PAS染色，較OVA+ALUM組呼吸道周圍炎癥細胞募集浸潤程度以及氣道粘液分泌程度明顯減輕，從而證明DT組肺臟內(nèi)在清除AM以

8、及DC后會導致肺部炎癥明顯下降，CD4+T增殖明顯降低;而在肺泡巨噬細胞被大量清除，DC已經(jīng)完全回歸的情況下，肺部雖存在炎癥，但較OVA+ALUM組相對較輕。
　　結(jié)論：
　　1、明確了肺部樹突狀細胞與肺泡巨噬細胞的分析策略，成功建立哮喘小鼠模型;
　　2、CD103+DCs與過敏性哮喘肺部炎癥過程中的TH2分化相關(guān);
　　3、DT清除肺部樹突狀細胞與肺泡巨噬細胞后，DC早AM約4天回歸;
　　4、肺泡巨噬