可誘導(dǎo)共刺激分子重組蛋白的研制及其在過敏性哮喘炎癥中的治療作用.pdf

1、本課題采用基因工程重組DNA技術(shù)克隆ICOS活性片段、構(gòu)建ICOS-mIg融合基因真核表達載體，在哺乳動物細胞中實現(xiàn)ICOS-mIg的高效表達，并通過親和層析技術(shù)純化重組蛋白；在此基礎(chǔ)上，進行了ICOS-mIg體內(nèi)外生物學(xué)功能的研究；觀察了ICOS-mIg阻斷共刺激通路對過敏性哮喘炎癥的影響；采用Insightll分子模擬的方法和配體親和篩選突變點，并構(gòu)建、表達獲得配體高結(jié)合活性ICOS突變體融合蛋白，用異基因混合淋巴細胞增殖抑制試驗檢

2、測突變體蛋白的生物學(xué)活性；另外經(jīng)過反復(fù)實驗，完成了基因工程人源ICOS-Ig的純化工藝研究，其結(jié)果符合生物制品檢定要求。 主要結(jié)果 1.基因工程重組ICOS-mIg表達系統(tǒng)的構(gòu)建及其生物活性研究 從受凝集素刺激后的人外周血單個核細胞中提取總RNA，以RT-PCR方法獲取編碼ICOS成熟蛋白胞外片段的cDNA，；將人ICOS胞外片段基因與小鼠免疫球蛋白重鏈基因在pGL3-basic克隆載體中連接成融合基因，并將IC

3、OS-mIg融合基因插入真核分泌型質(zhì)粒pSecTaq2/HygroA，構(gòu)建表達質(zhì)粒pSecTaq2/HygroA-ICOS-mIg，轉(zhuǎn)化CHO細胞，經(jīng)過抗生素篩選，獲得穩(wěn)定、高效表達細胞株，實現(xiàn)ICOS-mIg融合蛋白的表達；ELISA鑒定表達量可達100mg/L；用親和層析方法純化的蛋白能明顯抑制異基因小鼠的混合淋巴細胞反應(yīng)和淋巴細胞分泌細胞因子。這部分工作中，制備人源ICOS活性片段和小鼠免疫球蛋白片段的融合蛋白，并實現(xiàn)哺乳動物的真

4、核表達在國內(nèi)尚未見報道，為實驗研究B7RP-1/ICOS共刺激通路生物學(xué)功能與應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。 2.ICOS-mIg對過敏性哮喘炎癥的治療作用 取健康雌性BALB/c小鼠用分段隨機分組法將小鼠隨機分成6組，每組8只，分別為CTLA4-Ig/ICOS-mIg聯(lián)合治療組(A組)、CTLA4-Ig治療組(B組)、ICOS-mIg治療組(C組)、哮喘組(D組)、生理鹽水氣霧激發(fā)對照組(E組)、同型抗體對照組(F組)；建立雞

5、卵白蛋白(OVA)免疫BALB/c小鼠哮喘模型；給予ICOS-mIg、CTLA4-Ig、CTLA4-Ig/ICOS-mIg聯(lián)合治療后，觀察哮喘小鼠氣道壓力變化、支氣管肺泡灌洗液中細胞總數(shù)、各炎性細胞百分比及IL-4、IFN-γ和IgE含量的變化；采用FACS檢測Th亞群變化；取肺組織行病理組織學(xué)分析觀察肺內(nèi)炎癥情況。 結(jié)果顯示：(1)D組小鼠的氣道壓力(58±10％)較E、F對照組明顯增高(27±5％、33±9％，P＜0.01)

6、；A組(32±5％)、B組(26±5％)和C組(33±12％)較D組小鼠的氣道壓力顯著降低，其中B組的氣道壓力降低最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)各組小鼠BALF中的細胞計數(shù)、分類結(jié)果表明，D組小鼠的細胞總數(shù)(23±5×107/L)、中性粒細胞(1.8±1×107/L)、單個核細胞(5.6±2×107/L)和嗜酸性粒細胞(1.6±0.7×107/L)較E、F對照組明顯增高；嗜酸性粒細胞分類結(jié)果表明：A組(0.3±0.2×107/L)、B

7、組(0.2±0.1×107/L)和C組(0.1±0.3×107/L)較D組顯著下降，A、B、C個處理組之間無顯著差異；單個核細胞分類結(jié)果表明：A組(1.2±0.6×107/L)、B組(1.0±0.5×107/L)和C組(1.1±0.8×107/L)較D組顯著下降，A、B、C個處理組之間及各對照組間均無顯著差異；中性粒細胞分類結(jié)果各實驗組間無顯著差異。(3)外周血總IgE水平的檢測結(jié)果表明：D組小鼠外周血總IgE水平(282±21μg/L

8、)較E、F組(9.3±1.7、12.2±2.6μg/L)顯著升高；A組(128±13μg/L)、B組(100±17μg/L)和C組(175±33μg/L)均較D組顯著下降，其中C組水平最低。(4)各組小鼠BALF中細胞因子含量的檢測結(jié)果表明：D組小鼠BALF中IL-4水平(179±44ng/L)較E、F組(81±12ng/L、61±23ng/L)顯著升高；B組的IL-4水平(106±29ng/L)和C組(77±31ng/L)較D組明顯降

9、低，其中C組下降最明顯；A組(171±67ng/L)與D組相比無顯著差異。IFN-γ含量檢測結(jié)果表明：D組小鼠BALF中IFN-γ水平(615±133ng/L)較E、F組(1019±84ng/L、1021±122ng/L)顯著降低；C組(606±123ng/L)與D組無明顯差異。(5)Th1、Th2亞群的檢測結(jié)果表明：外周血和脾臟的Th2亞群比例D組(11.1±2.5％、7.21±0.89％)均明顯高于E、F組；A組(7.6±1.8％、

10、5.75±0.96％)、B組(4.2±1.6％、4.85±0.69％)、C組(4.5±1.0％、4.88±0.67％)均低于D組，其中B、C組水平最低。外周血和脾臟的TH1亞群比例各組間均無顯著差異。 3.ICOS突變體融合蛋白的構(gòu)建和生物學(xué)功能的鑒定 哺乳動物細胞表達ICOS-mIg的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，來源比較困難而且成本高、體內(nèi)用量大，限制了ICOS-mIg的研究和應(yīng)用。隨著共刺激分子配、受體分子結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)研究的深入

11、，這些信息為基因工程設(shè)計和改造天然免疫活性分子以提高其生物學(xué)活性提供了基礎(chǔ)。大量研究表明通過篩選突變型免疫活性蛋白可以獲得特異性活性目的蛋白。我們根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得CTLA4和配體B7-1/B7-2的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，以其為模板，利用Insightll分子模擬軟件所提供的生物信息學(xué)方法對rhICOS突變體結(jié)構(gòu)進行模擬分析，制備高配體結(jié)合活性的ICOS突變體融合蛋白。結(jié)果確定了一個單點(Q59K)的定點氨基酸突變和配體親和活性篩選。對獲

12、得的rhICOS突變體克隆的活性進行功能評價，將有可能提高ICOS融合蛋白與配體結(jié)合和增加其生物學(xué)活性。 4.重組ICOS-Ig生產(chǎn)工藝的初步研究 制備人ICOS胞外片段與人IgG1重鏈恒定片段融合基因真核表達載體，轉(zhuǎn)染工程細胞株CHO-K1，抗生素篩選穩(wěn)定、高效表達細胞株，無血清培養(yǎng)制備重組蛋白，收集細胞上清，采用親和層析技術(shù)和分子篩技術(shù)分離純化重組蛋白；SDS-PAGE電泳、HPLC純度分析檢測蛋白純度，蛋白質(zhì)N端測

13、序，肽譜圖分析，蛋白分子量測定，等電點測定，活性測定均符合理論和生物制品檢定的要求。 結(jié)論: 1.成功制備具有配體結(jié)合活性和T淋巴細胞功能抑制活性的ICOS-mIg重組蛋白。 2.ICOS-mIg重組蛋白治療的哮喘小鼠氣道壓力減小、氣道炎性細胞浸潤減輕，BALF中炎性細胞及嗜酸粒細胞數(shù)目減少，說明ICOS-mIg可以抑制哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)并且可以緩解癥狀。ICOS-mIg與CTLA4-Ig聯(lián)合治療可以明顯減少

14、OVA過敏性哮喘小鼠肺部的炎性滲出和浸潤及氣道阻力；可以減少BALF中炎性細胞的數(shù)量；與單獨用藥相比，無明顯差異。與ICOS-mIg的作用相比，雖然無統(tǒng)計學(xué)上的差異，但從數(shù)值上看，聯(lián)合用藥后，脾臟、外周血中的Th2亞群比例升高，BALF中IL-4水平下降，IFN-Y水平升高。在急性O(shè)VA過敏性哮喘小鼠模型中，ICOS-mIg和CTLA4-Ig聯(lián)合用藥的效果不明顯優(yōu)于ICOS-mIg或CTLA4-Ig。 4.采用分子模擬和配體親和