KIF5B-RET融合基因功能及相關藥物干預研究.pdf

1、目的:肺癌是全世界范圍死亡率最高的腫瘤。近年來，靶向治療成為肺癌研究的熱點。越來越多分子靶點的發(fā)現(xiàn)及靶向藥物的研發(fā)給肺癌患者長期生存帶來了希望。但是，只有特定基因型的患者才能從相應靶向藥物治療中獲益。因此，為使更多的患者從靶向治療中獲益，對非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者群體進行精確的分子亞型區(qū)分，成為了肺癌靶向治療成功的重要條件。2012年研究發(fā)現(xiàn)肺癌中存在一種新的融合基因KIF5B

2、-RET，其陽性患者多為不吸煙或很少吸煙的腺癌患者。其存在與其他已知的基因改變如EGFR、K-Ras、EML4-ALK等相互排斥，提示KIF5B-RET是一種新的致癌驅動突變，有可能成為非小細胞肺癌個體化診斷與治療的一個分子靶點。KIF5B-RET融合基因的功能性研究目前尚不深入，其基因功能有待深入探討。本研究主要應用慢病毒感染的手段構建KIF5B-RET融合基因陽性的穩(wěn)定轉染細胞株并初步探討KIF5B-RET融合基因對細胞在增殖、遷移

3、、凋亡方面的影響。
　　方法:本實驗采用分段PCR法分別擴增出KIF5B基因片段和RET基因片段，分別載入載體質粒后，與pCDH-CMV-MCS慢病毒表達載體進行連接后獲得載有完整KIF5B-RET基因片段的質粒，并進行慢病毒的包裝和生產，轉染BEAS2B肺上皮細胞后進行RT-PCR和Western blot鑒定獲得穩(wěn)定表達KIF5B-RET融合基因細胞株。采用CCK8及平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力，transwell法檢測細

4、胞遷移能力，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，western blot檢測信號通路蛋白激活及藥物抑制情況。
　　結果: RT-PCR檢測結果顯示KIF5B-RET-PCDH（KV2亞型）及KIF5B-RET4-PCDH（KV4亞型）慢病毒轉染BEAS2B細胞后兩種KIF5B-RET融合基因mRNA表達明顯，Western blot檢測結果顯示兩種KIF5B-RET融合蛋白表達明顯，說明BEAS2B-KIF5B-R

5、ET工具細胞構建成功?；蜣D染組在正常培養(yǎng)情況下對細胞增殖沒有影響，但在減血清濃度(5％)的情況下增殖情況有差異?；蜣D染組與對照組相比遷移能力增強。在減血清及加入順鉑凋亡誘導劑的情況下實驗組顯示出抗凋亡的能力。Western blot結果顯示多靶點酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼對KIF5B-RET蛋白具有抑制作用，并可以抑制其下游信號通路的激活。
　　結論:1.KIF5B-RET融合基因對細胞有抗凋亡的作用。
　　2.KIF5B