銀杏黃酮對(duì)酒精性氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、近年來(lái)人們興奮地發(fā)現(xiàn)，一些天然的黃酮類或多酚類抗氧化劑，如姜黃素、槲皮素、銀杏黃酮等可誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，并由此展示出協(xié)同而增強(qiáng)的抗氧化效應(yīng)和更為廣泛的藥理活性。有鑒如此，本研究以具有優(yōu)良抗氧化和護(hù)肝效應(yīng)的銀杏黃酮作為干預(yù)物，采用酶學(xué)與生化分析、RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)、WesternBlot、病理及超微病理等研究手段，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)，系統(tǒng)探討急、慢性酒精暴露及銀杏黃酮干預(yù)對(duì)血清和肝、心、腎、睪丸抗氧化系統(tǒng)及血清脂質(zhì)水平的影響，在此基礎(chǔ)上，

2、以肝損傷為重點(diǎn)，進(jìn)一步研究長(zhǎng)期酒精攝入與不同劑量銀杏黃酮干預(yù)對(duì)肝臟結(jié)構(gòu)與功能、線粒體與微粒體抗氧化系統(tǒng)以及HO-1mRNA、蛋白表達(dá)與酶活性(HO-1及CYP2E1)水平的影響，主要內(nèi)容如下： 第一部分:銀杏黃酮對(duì)小鼠急性酒精暴露后抗氧化系統(tǒng)的保護(hù)作用 盡管對(duì)酒精性損傷的氧化應(yīng)激機(jī)制已開(kāi)展了大量研究，但基于生物體的復(fù)雜性，乙醇攝入對(duì)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的具體影響至今報(bào)道不一。因此，本部分采用酶學(xué)與生化分析手段，探討小鼠急性酒精

3、暴露及銀杏黃酮干預(yù)后血清與肝臟抗氧化系統(tǒng)的變化，以探尋相應(yīng)的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：小鼠急性酒精暴露(4.8g/kg)后1～15h內(nèi)，血清與肝臟GSH水平與抗氧化酶活性呈“U”形變化，而MDA水平呈明顯的倒“U”形變化，且恢復(fù)較慢。其中血清GSH水平與SOD活性在2h降至最低，GSH-Px活性4h最低，降低幅度分別為23.5％、20.3％和20.2％，MDA水平4h最高(升幅32.4％)；肝臟GSH水平與GSH-Px、S

4、OD活性在4h降至最低，降低幅度分別為29.3％、18.4％和23.6％，而MDA水平在6h升至最高(升幅27.5％)。預(yù)先經(jīng)銀杏黃酮(96mg/kg)干預(yù)，可增強(qiáng)機(jī)體在急性乙醇暴露初期的代償反應(yīng)，減輕小鼠酒精攝入所致的GSH消耗、抗氧化酶失活和脂質(zhì)過(guò)氧化，促使受損的抗氧化系統(tǒng)盡快恢復(fù)。 以上結(jié)果表明，小鼠急性酒精暴露后2～6h，尤其是4h，可明顯影響到血清與肝臟的抗氧化水平，而銀杏黃酮干預(yù)可在一定程度上緩解這種影響而表現(xiàn)出良好

5、的保護(hù)效應(yīng)。 第二部分:大鼠酒精攝入后血清抗氧化系統(tǒng)與脂質(zhì)水平的動(dòng)態(tài)變化及銀杏黃酮的保護(hù)效應(yīng) 流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，飲酒量不同，心血管疾病與糖尿病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也各異，提示不同水平的酒精攝入可能對(duì)機(jī)體健康有不同的影響。因此，本部分以大鼠為研究對(duì)象，探討不同劑量的酒精持續(xù)攝入不同時(shí)間后，血清抗氧化水平與脂質(zhì)水平的動(dòng)態(tài)變化，在此基礎(chǔ)上，研究不同劑量的黃酮干預(yù)對(duì)不利變化的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大鼠攝入低劑量的酒精(0.8g

6、/kg)30、60、90天后，血清GSH、MDA、TG與TC水平無(wú)明顯變化，但SOD、CAT與GSH-Px活性則不斷升高，HDL-C在90天明顯升高；大鼠攝入中劑量的酒精(1.6g/kg)30、60、90天后，血清GSH水平逐漸下降，SOD與GSH-Px活性先升高后下降，CAT活性與MDA、TG、TC水平則持續(xù)升高，HDL-C輕微升高后逐漸回落；大鼠攝入高劑量的酒精(2.4g/kg)30、60、90天后，血清GSH與HDL-C水平及SO

7、D、GSH-Px活性不斷下降，CAT活性輕微升高后明顯下降，而MDA、TG、TC水平不斷上升。對(duì)高劑量酒精攝入大鼠進(jìn)行銀杏黃酮(48及96mg/kg)干預(yù)，尤其高劑量(96mg/kg)干預(yù)，在不同時(shí)間均可部分抑制或降低酒精所致的抗氧化酶失活程度、GSH與HDL-C水平的下降及TG、TC與MDA水平的上升幅度，緩解高劑量酒精攝入對(duì)血清脂質(zhì)水平及抗氧化系統(tǒng)的影響。 以上結(jié)果表明，低劑量酒精攝入，可在一定程度上激活機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)和升

8、高HDL-C水平，從而產(chǎn)生相應(yīng)的保護(hù)效應(yīng)；中劑量的酒精攝入，尤其是長(zhǎng)時(shí)間攝入后，血清脂質(zhì)水平及過(guò)氧化程度不斷升高，抗氧化水平總體呈先輕微升高后明顯下降的趨勢(shì)，氧化應(yīng)激不斷累積和加重；高劑量酒精攝入則進(jìn)一步加重機(jī)體的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝紊亂程度。對(duì)高劑量酒精攝入大鼠進(jìn)行銀杏黃酮干預(yù)，尤其是高劑量銀杏黃酮干預(yù)，可以緩解酒精的影響，顯示出明顯的調(diào)節(jié)血脂和拮抗酒精性氧化應(yīng)激的作用。 笫三部分:長(zhǎng)期酒精攝入對(duì)大鼠組織抗氧化系統(tǒng)的影響及銀杏黃

9、酮的干預(yù)作用 長(zhǎng)期嗜酒不僅嚴(yán)重影響到肝功能，還可誘發(fā)心肌受損、腎功能不全、睪丸生精異常等多器官的病變和損傷。乙醇的高度彌散性及在代謝過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量的自由基與活性氧，繼而引起多組織的氧化損傷，是酒精相關(guān)性疾病的重要發(fā)病機(jī)制。因此，本部分在觀察長(zhǎng)期高劑量的酒精攝入對(duì)肝、心、腎、睪丸抗氧化系統(tǒng)影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討銀杏黃酮干預(yù)對(duì)酒精誘導(dǎo)的多組織氧化損傷的保護(hù)作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大鼠攝入高劑量酒精(2.4g/kg)90天后，

10、除腎SOD及心CAT活性無(wú)明顯變化外，肝、心、腎、睪丸GSH水平、抗氧化酶活性及總抗氧化能力明顯下降，而MDA與ROS水平明顯升高。經(jīng)不同劑量的銀杏黃酮干預(yù)(48及96mg/kg)，尤其是高劑量(96mg/kg)干預(yù)，可明顯減輕或部分抑制因酒精染毒所致的GSH消耗、抗氧化酶失活及總抗氧化能力下降，降低ROS的產(chǎn)生水平和脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而在一定程度上緩解了酒精對(duì)肝、心、腎、睪丸抗氧化系統(tǒng)的影響。 以上結(jié)果表明，長(zhǎng)期高劑量的酒精攝

11、入可導(dǎo)致肝、心、腎、睪丸多器官的氧化-抗氧化失衡，而銀杏黃酮干預(yù)，尤其是高劑量銀杏黃酮干預(yù)，可以減輕或抑制酒精對(duì)多器官抗氧化系統(tǒng)的影響，對(duì)多組織酒精性氧化應(yīng)激具有良好的保護(hù)作用。 第四部分:銀杏黃酮防御酒精性肝損傷相關(guān)機(jī)制的研究 肝臟是酒精吸收后代謝的主要場(chǎng)所，也是酒精中毒的主要靶器官。本部分采用酶學(xué)與生化分析手段，并借助于RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)、WesternBlot及超微病理等方法，進(jìn)一步探討高劑量酒精攝入后，大鼠

12、肝臟結(jié)構(gòu)與功能、肝線粒體與微粒體氧化-抗氧化系統(tǒng)、CYP2E1活性及肝HO-1表達(dá)與酶活性的變化，在此基礎(chǔ)上，研究不同劑量銀杏黃酮的干預(yù)效果及相關(guān)機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：長(zhǎng)期的酒精攝入(2.4g/kg，90天)導(dǎo)致肝細(xì)胞嚴(yán)重脂變性、濁腫和水變性，肝功能異常，線粒體、微粒體出現(xiàn)明顯的腫脹、變形與退化等病理性改變，氧化-抗氧化失衡，CYP2E1活性升高近4倍，而HO-1mRNA、蛋白表達(dá)及酶活性水平分別下降55.0％、49.3％和45

13、.5％；銀杏黃酮(48及96mg/kg)干預(yù)，尤其高劑量(96mg/kg)干預(yù)，可明顯減輕乙醇所致的病理性改變和線粒體及微粒體的氧化損傷，抑制CYP2E1的活化，并在mRNA、蛋白與酶活性水平對(duì)HO-1具有明顯的誘導(dǎo)作用，而對(duì)其它抗氧化蛋白無(wú)明顯激活作用。 以上結(jié)果表明，長(zhǎng)期的酒精攝入削弱了肝細(xì)胞線粒體與微粒體抗氧化水平，抑制了HO-1的表達(dá)與活性；銀杏黃酮可能通過(guò)對(duì)HO-1的誘導(dǎo)而展示出協(xié)同和增強(qiáng)的抗氧化效應(yīng)，從而更有效清除乙

14、醇代謝過(guò)程中形成的大量ROS，保護(hù)機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，減輕乙醇所致的細(xì)胞和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)改變與功能損傷。 綜上所述，低劑量的酒精攝入，可能通過(guò)抗氧化系統(tǒng)的代償性活化和HDL-C水平的升高而發(fā)揮協(xié)同的保護(hù)作用，但過(guò)量(尤其是長(zhǎng)期過(guò)量)的酒精攝入，可導(dǎo)致嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝紊亂和多組織的氧化損傷。而銀杏黃酮干預(yù)可以明顯減輕酒精對(duì)機(jī)體脂質(zhì)代謝和抗氧化系統(tǒng)的不利影響，降低肝臟等多組織的氧化應(yīng)激程度，銀杏黃酮對(duì)HO-1的誘導(dǎo)可能介導(dǎo)了其拮抗酒精性氧化

15、應(yīng)激的作用。當(dāng)然，HO-1的介導(dǎo)作用有待在細(xì)胞水平利用HO-1特異性的抑制劑與誘導(dǎo)劑加以進(jìn)一步證實(shí)。此外，銀杏黃酮對(duì)HO-1誘導(dǎo)的信號(hào)通路，以及HO-1介導(dǎo)的保護(hù)效應(yīng)究竟是對(duì)底物的及時(shí)清除，還是某種代謝產(chǎn)物的作用，亦或是綜合作用的結(jié)果還有待進(jìn)一步深入研究。創(chuàng)新點(diǎn)： 1)一般認(rèn)為適量飲酒對(duì)機(jī)體的健康效應(yīng)可能與HDL-C有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)抗氧化系統(tǒng)代償性活化可能也參與了這種保護(hù)作用。 2)長(zhǎng)期過(guò)量的酒精攝入使機(jī)體逐步失代償而導(dǎo)