湖北麥冬規(guī)范化種植及其提取物的降血糖作用研究.pdf

1、湖北麥冬(Liripe spicata(Thunb．)Lour．var．prolifera Y．T．Ma)為(《中華人民共和國(guó)藥典》(1995年、2000年和2005年版)收載中藥品種“山麥冬”(Radix Liriopes)的主要來源植物，具有悠久的藥用歷史，早在宋代《圖經(jīng)本草》和《證類本草》中均有湖北“隨州麥門冬”的記載，據(jù)其藥圖考證，與現(xiàn)今藥用的湖北麥冬基本一致。 湖北麥冬是湖北的特有物種和道地藥材，主產(chǎn)于湖北省襄樊市，種

2、植面積已達(dá)5萬余畝，年產(chǎn)量近兩萬噸，約占全國(guó)麥冬類藥材總產(chǎn)量的50％以上，是當(dāng)前麥冬商品藥材的主流品種，種植湖北麥冬成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的主要產(chǎn)業(yè)之一。 本論文在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，運(yùn)用分子生物學(xué)、中藥栽培學(xué)、中藥鑒定學(xué)、藥理學(xué)等多學(xué)科交叉的方法對(duì)湖北麥冬及麥冬類植物ISSR鑒別、規(guī)范化種植、藥用部位的選擇與擴(kuò)大、有效成分的提取分離、藥效學(xué)及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)等進(jìn)行全方位系統(tǒng)研究，深入研究和證實(shí)湖北麥冬的藥用價(jià)值，真正提高湖北麥冬的產(chǎn)量、

3、質(zhì)量和品牌知名度，為湖北麥冬的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。 1．湖北麥冬規(guī)范化種植研究 1.1研究目的：對(duì)湖北麥冬進(jìn)行規(guī)范化種植(GAP)研究，對(duì)湖北麥冬藥材生產(chǎn)實(shí)施全面質(zhì)量管理，控制影響藥材質(zhì)量的各種因子，規(guī)范藥材生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)乃至全過程，以達(dá)到湖北麥冬藥材“安全、有效、產(chǎn)量穩(wěn)定、質(zhì)量穩(wěn)定、可控”的目的。形成優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、無公害的模式化栽培技術(shù)，制定出行之有效的中藥材生產(chǎn)、質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地指導(dǎo)中藥材種植

4、，從而提高湖北麥冬產(chǎn)量和質(zhì)量。 1.2研究方法：以《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GAP)實(shí)施指南》為指導(dǎo)，主要針對(duì)湖北麥冬的生長(zhǎng)特性、種植歷史和規(guī)模、產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境、物種鑒定、種質(zhì)來源、野生資源分布情況、生長(zhǎng)習(xí)性、良種繁育情況、適宜采收期、病蟲害綜合防治情況、質(zhì)量控制、種植流程及關(guān)鍵技術(shù)控制點(diǎn)、產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境檢測(cè)(包括土壤、灌溉水、大氣環(huán)境)、企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、取樣方法、生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)、管理規(guī)程、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、崗位職責(zé)等方面進(jìn)行研究

5、。 1.3研究結(jié)果：通過對(duì)湖北麥冬開展規(guī)范化種植研究，建立了一套較為完整、規(guī)范的栽培、種植、初加工的生產(chǎn)和質(zhì)量體系。制定出了《湖北麥冬種苗標(biāo)準(zhǔn)》、《湖北麥冬生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》(SOP)、《湖北麥冬企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》等。并能卓有成效地指導(dǎo)基地生產(chǎn)實(shí)踐，提高了湖北麥冬的產(chǎn)量、質(zhì)量和品牌知名度。 1.4研究結(jié)論：實(shí)施湖北麥冬規(guī)范化種植(GAP)研究，能從源頭上控制湖北麥冬藥材質(zhì)量，對(duì)保證湖北麥冬藥材、湖北麥冬飲片及湖北麥冬中成藥質(zhì)

6、量具有十分重要的意義。 2．湖北麥冬及其他麥冬類植物ISSR鑒別研究 2.1研究目的：對(duì)從形態(tài)上難以區(qū)分的湖北麥冬、短葶山麥冬、川麥冬、闊葉麥冬和細(xì)葉麥冬等麥冬類植物，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行鑒別研究，并研究其親緣關(guān)系。 2.2研究方法：選擇索萊寶植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，檢測(cè)其濃度，將產(chǎn)物置于-20℃低溫保存?zhèn)溆?；根?jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)五因素四水平正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化；從ISSR引

7、物序列表中隨機(jī)選取80條，按照正交試驗(yàn)優(yōu)化確定的反應(yīng)體系，對(duì)所有樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取對(duì)各樣品均能穩(wěn)定擴(kuò)增出三條以上電泳條帶的引物作為實(shí)驗(yàn)有效引物；對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠分離檢測(cè)，在凝膠成像分析系統(tǒng)下檢測(cè)提取效果并拍照；統(tǒng)計(jì)各樣品的電泳條帶，得到全部樣品的ISSR圖譜二態(tài)數(shù)據(jù)矩陣，用NTSYS2.10軟件計(jì)算個(gè)體間的Nei相似系數(shù)，進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建聚類系統(tǒng)樹狀圖。 2.3研究結(jié)果：通過正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)建立

8、了反應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好、條帶清晰的最佳ISSR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序；對(duì)麥冬類植物用此反應(yīng)體系進(jìn)行有效引物篩選，從80條引物中篩選出了9個(gè)有效引物，根據(jù)有效引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類和相似系數(shù)分析，結(jié)果證明麥冬類植物親緣關(guān)系十分接近，屬于同一種群，其中湖北麥冬和短葶山麥冬親緣關(guān)系較近，川麥冬和闊葉麥冬親緣關(guān)系較近，這與傳統(tǒng)分類及與品種鑒定結(jié)果相符。 2.4研究結(jié)論：ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可用于麥冬類藥材及近緣種的鑒別。 3．湖北

9、麥冬提取物(總多糖和總皂苷)的制備 3.1研究目的：研究利用大孔吸附樹脂同步提取、分離和純化湖北麥冬中總多糖和總皂苷，并制定制備流程。 3.2研究方法：對(duì)湖北麥冬藥材進(jìn)行水提，利用經(jīng)過預(yù)處理的大孔吸附樹脂分離湖北麥冬中的總多糖和總皂苷，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及醇沉的方法純化總多糖和總皂苷，并進(jìn)行含量測(cè)定。 3.3研究結(jié)果：通過大孔吸附樹脂同步提取、分離和純化湖北麥冬總多糖和總皂苷，得到含量為66.52％的總多糖及含量為81

10、.15％的總皂苷。 3.4研究結(jié)論：運(yùn)用大孔吸附樹脂法同步提取湖北麥冬中的總皂苷和總多糖，步驟少，操作性強(qiáng)，易產(chǎn)業(yè)化，值得推廣應(yīng)用。 4．湖北麥冬不同提取物降血糖作用的研究 4.1研究目的：為證實(shí)湖北麥冬所含總多糖和總皂苷是否與麥冬多糖和皂苷一樣具有降血糖作用，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用湖北麥冬總多糖、湖北麥冬總皂苷以及湖北麥冬總提取物，對(duì)四氧嘧啶糖尿病大鼠進(jìn)行降血糖作用的比較研究。 4.2研究方法：選擇體重(200

11、±20)g的Wistar大鼠，造模前測(cè)基礎(chǔ)血糖值，禁食24h，四氧嘧啶水溶液腹腔注射一次給藥(120mg/kg)，1次/d，連續(xù)2d。48h后測(cè)定禁食12h的空腹血糖(取大鼠尾血)，挑選空腹血糖值達(dá)到14.00mmol/L以上者繼續(xù)進(jìn)行降糖實(shí)驗(yàn)。 將造模成功大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別灌胃下列藥物：①高血糖模型組，正常喂食；②達(dá)美康組(0.04g/kg/d)；③湖北麥冬總多糖組(0.4g/kg/d)；④湖北麥冬總皂苷組(0

12、.4g/kg/d)；⑤湖北麥冬總提取物(水提液)組(5ml/kg/d)；⑥正常對(duì)照組10只，正常喂食。按以上劑量灌胃分別給予各種藥物，連續(xù)14d，第7d、14d給藥前空腹12h，測(cè)定血糖。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SPSS16統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 4.3研究結(jié)果：湖北麥冬總多糖、湖北麥冬總皂苷、湖北麥冬總提物與陽(yáng)性藥達(dá)美康一樣與模型組比較均有顯著性差異，說明湖北麥冬不同提取物對(duì)四氧嘧啶致糖尿病大鼠具有顯著降血糖作用，其中降糖效果為湖北麥冬