可溶性HLA-G1-肽復合物的體外折疊及其對混合淋巴細胞培養(yǎng)中T細胞增殖的影響.pdf

1、人類白細胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)G基因是1987年由Geraghty等克隆并測序的一類非經典HLAⅠ類基因，可通過不同的剪切方式翻譯出七種不同結構的蛋白，包括4種跨膜型和3種可溶性HLA-G(solubleHLA-G，sHLA-G)分子。對HLA-G的關注源于母胎耐受。胎兒基因組的一半來自父方，這些基因編碼的產物對母體而言是同種異體抗原，但正常情況下母體并不對胎兒的同種異體抗原產生免疫應答而導致對胎兒

2、的排斥。因此，母胎之間必然存在誘導并維持母胎耐受的機制。研究發(fā)現(xiàn)，胎盤絨毛膜細胞不表達經典的HLAⅠ、Ⅱ類分子，卻表達非經典的HLA-G分子。母胎界面上HLA分子表達的特殊性是導致母胎耐受的重要機制之一。 對HLA-G的研究最初集中于跨模型HLA-G1分子。研究證實，跨膜型HLA-G1分子可直接或間接與NK細胞、T細胞、樹突狀細胞、單核細胞及巨嗜細胞等免疫細胞表面的殺傷細胞抑制性受體(killerinhibitoryrecept

3、or,KIR)及ILT(immunoglobulin-liketranscripts/CD85)結合，激活其胞內段的免疫受體酪氨酸抑制基序(Immunologyreceptortyrosine-basedinhibitorymotifITIM)，啟動抑制性信號傳導通路，從而抑制免疫細胞的功能，誘導免疫耐受。 在妊娠早期，胎盤所有類型的滋養(yǎng)層細胞都分泌sHLA-G，母體血中sHLA-G含量與妊娠是否成功相關：若母體血中sHLA-G

4、含量高，則妊娠易成功；否則，妊娠不易成功。在某些腫瘤、感染、器官移植、自身免疫性疾病病人的血清及組織中檢測到sHLA-G。不表達膜型HLA-G1的HLA-G*0105N純合型健康個體能正常妊娠，這些現(xiàn)象提示sHLA-G同樣有著重要的功能。近年來對sHLA-G生物學功能研究成為HLA-G研究的新熱點。ContiniP等研究證實sHLA-G能抑制NK細胞，CD4+、CD8+T細胞的功能，但其具體機制沒有闡明。Fournel等研究表明，純化的

5、HLA-G5可在0.25μg/ml的低濃度下與CD8分子結合，刺激CD8+細胞表達CD95配體，通過Fas/FasL的途徑誘導CD8+細胞凋亡。而有些研究者在用分泌HLA-G5的細胞與T細胞一起孵育時并沒有觀察到T細胞的凋亡增加。最近有研究表明HLA-G5可以抑制同種反應T細胞的細胞周期但不促進其凋亡。LeRond等在體外用HLA-G5致敏初始T細胞18個小時，發(fā)現(xiàn)這些處理過的初始T細胞喪失了對其后同種抗原刺激的反應能力，并能抑制其他T

6、細胞的反應性。在混合淋巴細胞培養(yǎng)中，CD4+、CD8+T細胞均能表達可溶性或膜型HLA-G，作為一種負反饋信號調節(jié)CD4+同種反應性T細胞的增殖。 為闡明sHLA-G的生物學作用及其作用機制，有必要獲取大量有功能的sHLA-G分子，真核表達系統(tǒng)表達的可溶性蛋白雖然保持了蛋白原有的構象，但不能大量表達，且純化困難。而原核表達系統(tǒng)表達的包涵體蛋白不能保持蛋白原有的構象，也不能進行糖基化，因此需在體外進行折疊復性和功能鑒定。本課題研究

7、的目的是采用原核表達系統(tǒng)，制備大量有功能的sHLA-G1-肽復合物，并且利用同種異體T細胞混合培養(yǎng)的方法，觀察體外折疊的sHLA-G1-肽復合物對T細胞增殖反應的影響，為進一步闡明其作用機制及臨床應用奠定物質基礎。我們采用HLA-G限制性的九肽KGPPAALTL與sHLA-G1重鏈及輕鏈在體外經稀釋復性制備sHLA-G1-肽復合物，并建立同種異體混合淋巴細胞培養(yǎng)體系，驗證其生物學功能。本課題的研究內容和結果如下： 1、sHLA-

8、G1重鏈、β2m的高效表達和純化 sHLA-G1分子的兩個亞基sHLA-G1重鏈和β2m(輕鏈)均以包涵體的形式在細菌內高效表達，經IPTG誘導表達目的蛋白，提取包涵體并初步純化后溶于8mol/L尿素中。sHLA-G1重鏈和β2m的蛋白產量分別為180mg/L菌液和150mg/L菌液，灰度掃描純度分別為75.7％及65.8％，能夠滿足本研究制備sHLA-G1-抗原肽復合物的需要。 2、sHLA-G1-抗原肽復合物分子的稀

9、釋折疊復性 在分子結構上，HLA-G1與經典的HLAⅠ類分子一樣，均為包括重鏈、輕鏈和抗原肽的三分子復合物。在HLA-G1限制性的抗原肽存在的情況下，通過稀釋制備得到的β2m與sHLA-G1中的變性劑而實現(xiàn)體外復性折疊。來自于胎盤滋養(yǎng)層的九肽KGPPAALTL是從HLA-G上洗脫的三種內源性自身肽的一種，它的存在可幫助共折疊形成穩(wěn)定的sHLA-G1-抗原肽復合物分子。用已知僅與天然構象的HLAⅠ類分子結合的單克隆抗體W6/32進

10、行Western-blot鑒定，結果顯示W6/32同樣能夠結合于折疊復合物中的成份，進一步應用W6/32與抗β2m抗體進行雙抗夾心ELISA，證實體外折疊sHLA-G1-抗原肽復合物具有HLAⅠ類分子的天然構象，說明通過原核表達、體外折疊能夠成功地制備sHLA-G1單體。 3、sHLA-G1對混合淋巴細胞培養(yǎng)中T細胞增殖的影響 外周血淋巴細胞用羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(carboxyfluoresceindiace

11、tatesuccinimidylester，CFSE)標記后，用同種異體的EB病毒轉化的B淋巴母樣細胞(EBV-LCL)刺激，此為本實驗的混合淋巴細胞培養(yǎng)體系，代表針對同種異體抗原的T細胞應答。在96孔培養(yǎng)板中加入2×105熒光素標記的反應細胞和2×104刺激細胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第一天和第四天加入300μg/mlsHLA-G1-肽復合物及相同濃度的sHLA-A2-肽復合物、β2m作為對照，在第七天再次加入刺激細

12、胞和蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)三天后流式檢測T細胞的增殖情況，結果發(fā)現(xiàn)：三個個體中，sHLA-G1-肽復合物實驗組的增殖指數均明顯低于培養(yǎng)基對照組(個體一：5.5266±0.6124vs7.7350±0.4879；個體二：6.0566±0.4660vs8.9700±0.2353；個體三：5.8133±0.3470vs7.4600±0.5726；P＜0.05)，而HLA-G的單克隆抗體G11E5+sHLA-G1組與培養(yǎng)基組比較沒有明顯差異(個體一：7

13、.7050±0.0777vs7.7350±0.4879；個體二：9.5700±0.5091vs8.9700±0.2353;個體三：7.200±0.6763vs7.4600±0.5726;P＞0.05)。而sHLA-A2對照組在個體一、個體二中增殖指數都明顯低于培養(yǎng)基對照組(個體一：5.5633±0.3523vs7.7350±0.4879；個體二：7.0100±0.3111vs8.9700±0.2353；P＜0.05)，而在個體三中卻高于

14、培養(yǎng)基對照組(9.0933±0.3859vs7.4600±0.5726；P＜0.05)。這些結果顯示原核表達、體外折疊的sHLA-G1能夠抑制T細胞針對同種抗原的增殖反應。并且這種抑制作用能被針對HLA-Gα1區(qū)的單克隆抗體G11E5封閉。 可溶性HLA-G是近年來HLA-G研究的一個新的熱點，在體內可能發(fā)揮比膜型HLA-G更為重要的作用。本研究利用原核表達體系，在體外大量制備正確構像的sHLA-G1-肽復合物，并首次采用CFS