定心方及丹參酮ⅡA防治心肌缺血-再灌注損傷的作用及機制研究.pdf

1、一、背景
　　 隨著我國人們生活水平的提高及人口老齡化的加快,冠心病的發(fā)病率和死亡率呈迅速上升趨勢,是中國居民死因構(gòu)成中上升最快的疾病,已成為威脅中國公眾健康的重要疾病,從而被稱作是“人類的第一殺手”?，F(xiàn)代醫(yī)療技術的進步,使冠心病的診斷和治療有了長足的進步。靜脈溶栓術、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術、冠狀動脈內(nèi)支架置入術等血運重建技術廣泛運用于臨床后,冠心病急性心肌梗死的死亡率明顯下降,但隨之而來的心肌缺血.再灌注損傷(myocardi

2、alischemia/reperfusion injury,MI/RI)又成為威脅病人生命的重要因素。因此,探討MI/RI的病理機制及研究有效的防治藥物意義重大。
　　 MI/RI是指心肌血供在短時間中斷的一定時間內(nèi)恢復血供,原缺血心肌發(fā)生較血供恢復前更為嚴重的損傷。主要表現(xiàn)為再灌注心律失常、無復流、心肌頓抑、微循環(huán)障礙、甚至猝死等一系列病情反而惡化的現(xiàn)象。其病理過程復雜,涉及多個環(huán)節(jié)。過去對于MI/RI的基礎和臨床研究多集中在

3、抑制氧自由基、拮抗心肌細胞內(nèi)鈣超載等方面,近來認為MI/RI主要是一種炎癥反應過程,即以中性粒細胞(PMN)為主體,血小板、血管內(nèi)皮細胞共同參與,在細胞因子、補體等多種生物活性物質(zhì)共同作用下,由粘附分子介導的PMN與血管內(nèi)皮細胞粘附向心肌浸潤并釋放大量氧自由基和酶類,在細胞、亞細胞甚至基因水平造成多種形式的損傷過程。研究表明,MI/RI時PMN的粘附、滲透、趨化、激活與穿內(nèi)皮遷移,有賴于多種粘附分子和細胞因子,其中較有影響的是腫瘤壞死因

4、子α(TNF-α)、白細胞介素-1(Interleakin-1,IL-1)、白細胞介素-6(Intedeakin-6,IL-6)等。這些細胞因子能直接抑制心肌的收縮功能,導致心輸出量下降,促發(fā)心肌細胞凋亡,直接和間接地增加PMN表面粘附分子CD11b及內(nèi)皮細胞和心肌表面細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達。
　　 近年來,中醫(yī)藥在心血管疾病的防治上取得了很大的進展。祖國醫(yī)學雖然沒有MI/RI的概念,但從病因、臨床表現(xiàn)、轉(zhuǎn)歸等

5、特征來看,散見于中醫(yī)“胸痹”、“心悸”、“厥心痛”、“脫證”等病的記載中?？偛C可概括為本虛標實,本虛者,因稟賦不足,年邁腎衰,營血虛少引起心之陰陽、氣血虛損,特別是心氣虛和心陰虛,并根源于脾腎；標實者,系膏梁厚味、七情過激、勞逸失度、壅瘀生熱產(chǎn)生之氣滯、血瘀、痰濁、寒凝、熱結(jié),特別是痰瘀互結(jié),阻遏胸陽,閉塞心絡,痹而致痛。臨床上多表現(xiàn)為虛實夾雜、相互轉(zhuǎn)化。治療原則以補益氣血、調(diào)理陰陽、活血化瘀、化痰滌飲為主。
　　 中藥復方定

6、心方(DingXin Recipe,DXR)是我校臨床治療快速性心律失常的經(jīng)驗方,具有清心安神、益氣活血之功效。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)定心方能明顯減輕MI/RI,有效減少再灌注心律失常的發(fā)生。定心方主藥丹參是含有多種活性成分的中藥,臨床廣泛應用于心血管疾病的防治。其有效成分丹參酮Ⅱ A(Tanshinone Ⅱ A)是其含量最高的脂溶性活性成分,對受損心肌有很好的保護作用。本課題組前期關于定心方防治MI/RI做了大量相關研究,但在炎癥方面的機

7、制研究涉獵較少。另外,前期蛋白質(zhì)組學研究顯示,抗增殖蛋白(Prohibitin,PHB)在MI/RI模型組和正常組間存在顯著差異表達,與國外研究結(jié)果不謀而合。而且有研究證明,在腸上皮細胞炎癥因子IL-6刺激能夠增加PHB蛋白及mRNA水平的表達,并且能夠誘發(fā)PHB啟動因子激活,但在心肌方面的研究較少。
　　 二、目的
　　 本課題擬在以往研究基礎之上,采用大鼠MI/RI動物模型,從心律失常評分和心肌病理兩方面觀察中藥復方

8、定心方及單體丹參酮ⅡA是否具有抑制MI/RI,發(fā)揮心臟保護作用；研究MI/RI大鼠血清中炎癥因子IL-6及心肌組織中IL-6mRNA表達的變化及定心方及丹參酮Ⅱ A對其的影響；同時在蛋白質(zhì)組學水平研究MI/RI大鼠PHB蛋白表達的變化及定心方和丹參酮Ⅱ A的干預作用；初步探討在MI/RI中,炎癥因子IL-6與PHB蛋白是否具有相關性。從而在動物水平上證實中藥復方定心方和單體丹參酮ⅡA防治缺血性心臟病的可行性,為闡明MI/RI的發(fā)病機制、

9、研制開發(fā)新型、安全的防治缺血性心臟病的中藥制劑提供一定的實驗依據(jù)。
　　 三、方法
　　 32只成年雄性Wistar大鼠隨機分為4組,每組8只,分別為假手術組(shamoperated group,SH組)、心肌缺血一再灌注組(myocardial ischemia-reperfusiongroup,MI/RI組)、定心方干預組(DingXin Recipe group,DXR組)及丹參酮ⅡA干預組(Tanshinone

10、 ⅡA group,Tan組)。所有動物均適應性喂養(yǎng)7天。SH組、MI/RI組和Tan組均灌服生理鹽水,DXR組灌服定心方藥液,分上下午兩次,連續(xù)灌胃7天后,MI/RI組、DXR組和Tan組手術造模,SH組冠脈只穿線但不結(jié)扎,Tan組術前尾靜脈注射給藥。
　　 根據(jù)《藥理實驗方法學》“麻醉大鼠冠脈結(jié)扎再松開法”改進并制作MI/RI動物模型。連接心電圖機和心電示波器,觀察心律失常的發(fā)生,詳細記錄再灌注期間的心律失常,并進行室性心律

11、失常的量化評分,以評價再灌注損傷的程度；腹主動脈取血,分離血清；取心臟,冰生理鹽水沖洗,分離左心室,一部分直接放入10％中性福爾馬林溶液中固定,一部分放入-80℃冰箱中保存。
　　 左冠脈結(jié)扎和再灌注誘發(fā)的心律失常以室早(ventricular extrasystole,VE)、室速(ventricular tachycardia,VT)、室顫(ventricular fibrillation,VF)等室性心律失常(ventri

12、cular arrhythmia,VA)為主,故根據(jù)Cutis等創(chuàng)立的VA評分方法,進行室性心律失常評分。
　　 福爾馬林溶液固定后的心肌組織常規(guī)石蠟包埋、切片。常規(guī)HE染色觀察心肌組織形態(tài)學改變；觀察缺血.再灌注損傷時心肌組織形態(tài)的變化及定心方和丹參酮ⅡA對其的保護作用。
　　 腹主動脈采血分離的血清,采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清中IL-6的表達,觀察定心方及丹參酮Ⅱ A對缺血一再灌注損傷大鼠血清IL-6

13、表達的影響。
　　 部分心肌組織提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應技術(Real Time RT-PCR)檢測IL-6mRNA的表達,觀察定心方及丹參酮Ⅱ A對再灌注損傷大鼠IL-6mRNA表達的影響。
　　 部分心肌組織提取心肌組織蛋白,進行蛋白印跡實驗。分別采用免疫印跡法及SABC免疫組化法檢測心肌PHB蛋白的表達,觀察缺血-再灌注損傷大鼠心肌PHB蛋白表達的變化及定心方及丹參酮Ⅱ

14、A對其表達的影響。
　　 心律失常評分屬于多組等級資料,采用完全隨機設計資料的秩和檢驗(Kruskal-Wallis)方法進行分析,實驗數(shù)據(jù)以平均秩次表示。其余數(shù)據(jù)屬完全隨機設計的計量資料,故采用單因素方差分析(One-WayANOVA)方法進行分析,方差齊時用Bonferroni法進行多重比較,方差不齊時采用Dunnett's T3法,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±準差((x)±s)表示,兩個變量間的相關性分析采用Pearson相關性分析法

15、。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　 四、結(jié)論
　　 1、缺血-再灌注損傷容易誘發(fā)大鼠心律失常,定心方及丹參酮ⅡA可以顯著減少心律失常的發(fā)生,減輕缺血-再灌注損傷的嚴重程度。
　　 2、定心方及丹參酮Ⅱ A對缺血-再灌注損傷大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)具有良好的保護作用。
　　 3、心肌缺血-再灌注損傷引起大鼠血清IL-6含量顯著增高,定心方及丹參酮ⅡA可以顯著減少IL-