大鼠卵巢組織直接覆蓋式玻璃化冷凍保存和自體移植的研究.pdf

1、隨著惡性腫瘤診治技術(shù)的不斷進(jìn)展，腫瘤患者預(yù)后明顯改善，生存率顯著提高。腫瘤治療領(lǐng)域的進(jìn)步很大程度上得益于大劑量聯(lián)合化療和放療等治療手段的不斷改進(jìn)。然而卵巢對(duì)具有細(xì)胞毒性的藥物特別是烷化劑和電離輻射相當(dāng)敏感，處于兒童期、青少年期和成年期的女性患者接受上述治療后，卵泡大量丟失使卵巢儲(chǔ)備功能受到極大的損傷。卵巢是女性重要的生殖內(nèi)分泌器官，能夠產(chǎn)生性激素、維持內(nèi)分泌及生成卵子，它的損害會(huì)導(dǎo)致閉經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、性欲減退、第二性征不發(fā)育、卵巢早衰和不

2、育等嚴(yán)重臨床后果。卵巢組織的冷凍保存及移植正成為因大劑量放化療等因素引起卵巢衰竭的患者保留卵巢內(nèi)分泌及生殖功能最具前景的選擇。目前，卵巢組織的保存主要有傳統(tǒng)的慢速凍存法和玻璃化冷凍法。雖然前者已經(jīng)取得了一系列的成果，但是這種方法需要程序冷凍儀精密控溫，液氮消耗量大，所需時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用較高，且卵巢組織結(jié)構(gòu)較致密，含有多種不同類(lèi)型的細(xì)胞，對(duì)冷凍平衡要求各不相同而且差異較大。玻璃化冷凍技術(shù)是近10多年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)冷凍保存新技術(shù)，它簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)

3、，不會(huì)因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)冰晶的形成而使細(xì)胞受到損傷，較傳統(tǒng)的程序化冷凍有諸多優(yōu)勢(shì)。但玻璃化冷凍技術(shù)需要高濃度的冷凍保護(hù)劑(CPA)，而高濃度的CPA對(duì)組織細(xì)胞有一定的毒性作用，CPA的細(xì)胞毒性作用是冷凍生物學(xué)的主要限制因素之一。如何既降低CPA的細(xì)胞毒性，減少作用的時(shí)間，又促進(jìn)滲透性CPA充分進(jìn)入組織和細(xì)胞內(nèi)達(dá)到有效保護(hù)濃度，提高玻璃化冷凍效果，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。Chen報(bào)道直接覆蓋式玻璃化冷凍法—Directcovervitrificatio

4、n(DCV)，即用較低濃度冷凍保護(hù)液且組織與液氮直接接觸，應(yīng)用于保存小鼠卵巢組織并取得滿(mǎn)意的效果，但在其他動(dòng)物和人類(lèi)的卵巢組織中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。 促性腺激素釋放激素類(lèi)似物(GnRHa)是人工合成的促性腺激素釋放激素，具有較強(qiáng)的性腺抑制作用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有許多研究應(yīng)用GnRHa旨在抑制卵巢排卵、卵泡發(fā)育，在未成熟卵泡占優(yōu)勢(shì)的情況，將抗癌藥的影響減少到最低限度。目前認(rèn)為化療期間聯(lián)合應(yīng)用GnRHa有助于卵巢功能的保護(hù)并有利于今后生育

5、功能的恢復(fù)。在卵巢組織冷凍保存的研究中發(fā)現(xiàn)，原始卵泡更能耐受冷凍復(fù)蘇的過(guò)程，而初級(jí)卵泡等生長(zhǎng)卵泡更易發(fā)生冷凍損傷。如果在獲取卵巢組織前應(yīng)用GnRHa，抑制卵泡的募集、發(fā)育，使卵泡盡可能地停留在原始卵泡階段，是否有利于有利于更多的卵泡渡過(guò)低溫冷凍期？從而減少卵巢組織的冷凍損傷？國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)均無(wú)相關(guān)報(bào)道。 本研究以雌性性成熟SD大鼠為研究對(duì)象，采用直接覆蓋式玻璃化冷凍方法，并設(shè)計(jì)了三種濃度的冷凍保護(hù)液，通過(guò)組織學(xué)、組織熒光活/死性染

6、色(Live/DeadAssay)、TUNEL、透射電鏡檢測(cè)方法，比較與常規(guī)玻璃化冷凍方法對(duì)卵巢組織保存效果間的差別并探索直接覆蓋式玻璃化冷凍最佳冷凍液濃度；初步探討GnRHa預(yù)處理對(duì)大鼠卵巢組織的冷凍損傷的影響，以及自體移植后卵巢功能恢復(fù)、卵泡生長(zhǎng)和血供建立可能產(chǎn)生的影響。 第一部分、大鼠卵巢組織兩種玻璃化冷凍保存方案的比較研究 目的： 比較大鼠卵巢組織直接覆蓋式玻璃化冷凍和常規(guī)玻璃化冷凍法的冷凍效果，并探索直

7、接覆蓋式玻璃化冷凍的適宜濃度。 方法： (1)將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組：新鮮對(duì)照組，常規(guī)玻璃化冷凍組(CV)，直接覆蓋式玻璃化冷凍組(DCV)，采用3種冷凍保護(hù)液濃度分別為DCV1組，DCV2組，DCV3組。 (2)建立大鼠卵巢組織的直接覆蓋式玻璃化冷凍(DCV)和常規(guī)玻璃化冷凍法(CV)保存方案。 (3)各組冷凍復(fù)蘇后卵巢組織采用以下方法來(lái)評(píng)估凍存復(fù)蘇效果： ①組織學(xué)觀察各級(jí)卵泡形態(tài)的變化。

8、 ②熒光染色法觀察卵泡的存活和壞死情況。 ③TUNEL法檢測(cè)卵巢組織中卵泡的凋亡情況。 ④透射電鏡觀察卵泡超微結(jié)構(gòu)的改變。 第二部分、大鼠卵巢組織自體移植的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 建立大鼠自體移植模型，觀察新鮮卵巢組織片和各凍融組卵巢組織異位移植后的生長(zhǎng)情況，分析不同冷凍方案對(duì)卵巢組織移植后生長(zhǎng)的影響，從而進(jìn)一步判斷各冷凍方案的優(yōu)劣。 方法： (1)各組卵巢組織進(jìn)行冷凍保存、復(fù)蘇

9、后，自體移植至兩側(cè)腹股溝區(qū)肌肉層內(nèi)。A(CV移植組)，B1(DCV1移植組)，B2(DCV2移植組)，B3(DCV3移植組)，C(新鮮卵巢組織移植組)，并設(shè)D(去勢(shì)組)，E(假手術(shù)組)作為對(duì)照。 (2)通過(guò)陰道上皮細(xì)胞觀察動(dòng)情周期恢復(fù)時(shí)間及恢復(fù)率。 (3)移植后4周左右測(cè)血清E2，F(xiàn)SH水平。 (4)移植后30天取出移植的卵巢，HE切片觀察移植后卵巢卵泡形態(tài)和卵泡密度。 第三部分、GnRHa預(yù)處理對(duì)大鼠卵

10、巢組織的冷凍保存及自體移植的影響 目的： 初步探討GnRHa預(yù)處理對(duì)大鼠卵巢組織的冷凍損傷的影響，以及自體移植后卵巢功能恢復(fù)、卵泡生長(zhǎng)和血供建立可能產(chǎn)生的影響。 方法： (1)50只SD大鼠隨機(jī)分為4組，A組(GnRHa組)：術(shù)前5周每隔30天給予大鼠皮下注射GnRHa0.25mg，共兩次；B組(對(duì)照組)：皮下注射注射生理鹽水；C組：假手術(shù)組；D組：去勢(shì)組。 (2)GnRHa用藥后5周評(píng)估：血E2

11、，F(xiàn)SH水平；HE切片觀察卵泡數(shù)目和各級(jí)卵泡比例的變化。 (3)冷凍復(fù)蘇后卵巢組織的評(píng)估： ①組織學(xué)觀察卵泡形態(tài)和其中形態(tài)正常的各級(jí)卵泡比例。 ②熒光染色法觀察卵泡的存活和壞死情況。 ③TUNEL法檢測(cè)卵巢組織中卵泡的凋亡率。 (4)分別在移植后第3天，第7天，第14天，第30天，第60天回收移植物。 ①HE切片觀察卵巢組織切片中卵泡的形態(tài)，比較各時(shí)間點(diǎn)各組不同階段卵泡所占的比例，動(dòng)態(tài)觀察

12、移植物中卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)的情況。 ②免疫組化法檢測(cè)移植物中各時(shí)間點(diǎn)VEGF蛋白的表達(dá) 全文結(jié)論： (1)以7.5％EG+7.5％DMSO+DPBS/15％EG+15％DMSO+DPBS為冷凍保護(hù)液結(jié)合直接覆蓋式玻璃化技術(shù)(DCV)是適合大鼠卵巢組織凍存的理想方案，優(yōu)于常規(guī)玻璃化冷凍法。 (2)各凍存組的卵巢組織自體移植后可以存活并具有與新鮮卵巢組織相接近的激素分泌能力。 (3)大腿根部肌肉層作為移植部