丹酚酸A對腦微血管栓塞大鼠的影響及機(jī)制研究.pdf

1、中國2010年第六次人口普查敲響了人口老齡化的警鐘,隨著時間的推移,中國老年人口比例將不斷升高。腦血管疾病和血管性癡呆嚴(yán)重危害人類健康,尤其是老年人的健康。腔隙性腦梗塞為發(fā)生于微血管的腦血管疾病,約占中風(fēng)病人的25％,在中國,腔隙性腦梗塞是最常見的腦卒中類型之一。腔隙性腦梗塞多起病隱匿,易復(fù)發(fā),多次復(fù)發(fā)極易導(dǎo)致腔隙性腦梗塞性癡呆。目前尚無療效明確的藥物用于防治腔隙性腦梗塞及其引起的癡呆。因此,防治腔隙性腦梗塞藥物研發(fā)具有重要的意義。

2、r>　　 丹酚酸A為丹參的水溶性活性成分之一,前期的研究表明丹酚酸A具有廣泛的藥理學(xué)活性,除了強(qiáng)烈的抗氧化作用,還具有抑制血栓形成、保護(hù)心、腦血管損傷、抗肝損傷、肝纖維化和抗腫瘤等作用。對大鼠急性腦缺血再灌注、腦缺血再灌注導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙及地西泮引起的大鼠順行性遺忘,丹酚酸A均具有顯著的改善作用。大鼠腦內(nèi)注射栓子是栓塞性腦缺血模型的常用制備方法,可用來模擬臨床腔隙性腦梗塞。本文在前人研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化大鼠腦微血管栓塞模型并觀察丹酚酸A

3、對其影響和可能的機(jī)制。
　　 第一章外源性血栓栓塞性大鼠腦損傷模型的研究
　　 采用頸外動脈注射三種不同粒徑的大鼠同種異體血栓,制備腦微血管栓塞模型,觀察血栓粒徑與大鼠腦損傷形式及認(rèn)知障礙的相關(guān)性。
　　 1.頸外動脈注射三種不同粒徑血栓(150μm-178μm,74μm-124μm和48μm-74μm)均可引起局部腦區(qū)血流迅速降低到30％以下,隨后均有不同程度的升高,1 h時相對腦血流分別為37.7％,40.2

4、％和60.2％；24 h后模型組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分顯著升高,分別為2.55,1.75和1.67,表明粒徑越大引起的腦血流降低程度越大,神經(jīng)行為學(xué)障礙越明顯；HE染色結(jié)果表明,與大粒徑組和中粒徑組相比,小粒徑血栓可引起海馬CA1區(qū)和CA2-3區(qū)較大面積的、穩(wěn)定、均一的損傷。另外,三個粒徑均能引起大鼠腦皮層組織散在、彌漫的損傷。
　　 2.注射栓子1個月后的大鼠水迷宮實驗未表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶障礙,2個月時水迷宮實驗表明小粒徑和大粒徑血栓

5、均可導(dǎo)致大鼠顯著的學(xué)習(xí)記憶障礙,表現(xiàn)為逃避潛伏期延長,探索實驗中大鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)及大鼠在目標(biāo)現(xiàn)象游過的路程顯著減少,這可能與大鼠海馬尤其CA1區(qū)梗塞面積較大和大小均一有關(guān)。而中粒徑組大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙不明顯,這與HE染色顯示中粒徑組大鼠CA1損傷面積最小結(jié)果是一致的。
　　 綜合分析大鼠注射栓子24 h與2個月的實驗,結(jié)果表明頸外動脈注射大粒徑和小粒徑栓子均可引起大鼠海馬較大面積的,穩(wěn)定、均一的損傷,導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶功

6、能障礙。但是考慮到小粒徑直徑為48μm-74μm小于腦微血管直徑(100μm),而大粒徑栓子直徑為150μm-178μm大于100μm,因此,我們選擇采用小粒徑血栓制備大鼠腦微血管栓塞模型。
　　 第二章丹酚酸A對急性腦微血管栓塞大鼠的保護(hù)作用
　　 采用小粒徑血栓(48μm-74μm)制備大鼠急性腦微血管栓塞模型,觀察丹酚酸A對其保護(hù)作用。得出以下結(jié)論:
　　 1.對于腦微血管栓塞引起的腦損傷,預(yù)防性尾靜脈給予

7、丹酚酸A能夠顯著降低大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分,降低腦組織氧自由基標(biāo)志物MDA的水平,升高抗氧化物質(zhì)GSH-Px活性,升高NOS和NO水平。最終改善外源性血栓對血腦屏障和神經(jīng)元的損傷,發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　 2.預(yù)防性尾靜脈給予丹酚酸A可顯著降低微血栓引起的全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞聚集率和血小板聚集率的升高,而對凝血四項的影響不明顯。因此,丹酚酸A可改善血栓引起的血液流變學(xué)和血小板的病理性變化,發(fā)揮對腦組織的保護(hù)作用。尾靜脈注射丹酚酸

8、A(0.3～3 mg/kg)抗血小板聚集的能力與口服給予阿司匹林(100mg/kg)相近。
　　 第三章丹酚酸A對腦微血管栓塞大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響及機(jī)制研究
　　 通過Morris水迷宮研究丹酚酸A對腦微血管栓塞大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響,初步探討丹酚酸A對微血管栓塞大鼠膽堿能系統(tǒng),神經(jīng)生長因子和可溶性環(huán)氧化物水解酶的影響。
　　 實驗結(jié)果表明:
　　 1.連續(xù)2個月尾靜脈給予丹酚酸A,每天一次,能

9、夠顯著降低腦微血管栓塞大鼠逃避潛伏期,增加大鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)及大鼠在目標(biāo)象限游過的路程,最終改善大鼠腦微血管栓塞引起的學(xué)習(xí)記憶障礙,1 mg/kg作用最佳。
　　 2.連續(xù)給予丹酚酸A2個月能夠顯著降低腦微血管栓塞大鼠腦組織ROS含量。
　　 3.體外實驗結(jié)果表明,丹酚酸A具有一定的抑制乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的作用。而體內(nèi)實驗結(jié)果表明,連續(xù)2個月應(yīng)用丹酚酸A可顯著降低腦微血管栓塞大鼠血清和腦組織乙酰膽堿酯酶

10、的水平。
　　 4.與正常大鼠相比,大鼠腦微血管栓塞后2個月海馬CA1區(qū)ChAT活性無明顯變化,而連續(xù)2個月應(yīng)用丹酚酸A可升高海馬CA1區(qū)ChAT活性。
　　 5.腦微血管栓塞后2個月,大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)生長因子BDNF及VEGF活性顯著降低,而連續(xù)2個月應(yīng)用丹酚酸A可明顯升高海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF活性。
　　 6.腦微血管栓塞后2個月,大鼠海馬CA1區(qū)sEH活性顯著升高,而連續(xù)2個月應(yīng)用丹酚酸A可明顯

11、降低海馬CAl區(qū)sEH活性。
　　 7.MRI研究和HE染色表明,腦內(nèi)注射微血栓5個月可造成大鼠腦皮層及海馬組織的明顯損傷,而連續(xù)給予丹酚酸A治療5個月可顯著減輕大鼠腦皮層、海馬的損傷。
　　 綜上所述,連續(xù)給予丹酚酸A可顯著減小大鼠腦微血管栓塞所致梗塞面積,降低腦組織ROS水平,促進(jìn)腦組織恢復(fù),顯著改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能,這與長期應(yīng)用丹酚酸A促進(jìn)膽堿能系統(tǒng)紊亂正?；?增加海馬CA1區(qū)神經(jīng)生長因子BDNF和VEGF活性有關(guān)

12、。丹酚酸A還能夠通過降低海馬CA1區(qū)sEH活性,從而抑制具有腦保護(hù)作用的EETS的降解而發(fā)揮保護(hù)性作用。
　　 第四章丹酚酸A對SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　 在明確丹酚酸A對腦微血管栓塞大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用之后,在細(xì)胞水平觀察丹酚酸A對過氧化氫致神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并初步探討可能的機(jī)制。
　　 1.丹酚酸A與MTS校正實驗證實,丹酚酸A濃度為10-5M時會導(dǎo)致背景吸光值的增加,影響MTS

13、測定結(jié)果；丹酚酸A預(yù)孵育SH-SY5Y細(xì)胞24 h證實,丹酚酸A10-5 M能夠降低細(xì)胞活力,具有細(xì)胞毒性作用,結(jié)合兩方面實驗結(jié)果,后續(xù)的實驗我們采用丹酚酸A的濃度為(10-6M-10-6 M)。
　　 2.丹酚酸A可顯著增加過氧化氫致原代皮層海馬神經(jīng)元和SH-SY5Y細(xì)胞損傷4 h后的細(xì)胞活力,以10-8培M濃度作用最佳。
　　 3.丹酚酸A對過氧化氫致SH-SY5Y細(xì)胞損傷24 h具有顯著的保護(hù)作用,能夠升高過氧化氫

14、所致ATP降低和線粒體膜電位升高,減少細(xì)胞凋亡,增加細(xì)胞存活率。
　　 4.Western Blot結(jié)果表明過氧化氫作用于SH-SY5Y細(xì)胞5 min即可引起AMPK總蛋白水平和磷酸化水平顯著升高。給予丹酚酸A預(yù)孵育30 min能夠顯著抑制AMPK磷酸化水平的升高,10-9M作用最強(qiáng)。
　　 5.過氧化氫作用于SH-SY5Y細(xì)胞5 min即可引起Akt總蛋白水平和磷酸化水平顯著升高。給予丹酚酸A預(yù)孵育30 min能夠顯著

15、抑制Akt總蛋白水平和磷酸化水平的升高,10-9M作用最強(qiáng)。
　　 6.過氧化氫作用于SH-SY5Y細(xì)胞5 min即可引起ERK1/2磷酸化水平顯著降低。給予丹酚酸A預(yù)孵育30 min能夠顯著升高ERK1/2磷酸化水平,10-8M作用最強(qiáng)。
　　 綜上所述,丹酚酸A對過氧化氫所致SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用,表現(xiàn)在升高過氧化氫所致ATP降低和線粒體膜電位升高,減少細(xì)胞凋亡,最終增加細(xì)胞存活率。這與丹酚酸A能夠

16、抑制AMPK和Akt磷酸化水平,降低能量消耗,增加糖原合成,減少糖酵解和糖轉(zhuǎn)運(yùn),增加能量儲備有關(guān),另外丹酚酸A升高ERK1/2磷酸化水平也參與了對過氧化氫所致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　 綜合第二、三、四章研究結(jié)果,可以認(rèn)為,丹酚酸A主要是通過以下幾個方面防治腦微血管栓塞:
　　 (1)抗血小板聚集,抑制微血栓形成；
　　 (2)改善腦血流動力學(xué)狀態(tài)；
　　 (3)增強(qiáng)抗氧化能力,減輕機(jī)體過氧