高游離脂肪酸誘導(dǎo)血管局部氧化應(yīng)激損傷的分子機(jī)制及中藥干預(yù)研究.pdf

1、研究目的：高游離脂肪酸(FFA)血癥是代謝綜合征的代謝特征性之一，高FFA血癥可導(dǎo)致機(jī)體胰島素抵抗，然而二者之間的相互關(guān)系尚未完全闡明?，F(xiàn)有研究表明高FFA血癥能損傷細(xì)胞線粒體功能，使活性氧簇(ROS)生成增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。抗氧化治療能否改善FFA介導(dǎo)的機(jī)體胰島素抵抗，目前尚缺乏相關(guān)研究。本研究通過外源性升高SD大鼠循環(huán)中FFA水平，并用抗氧化劑進(jìn)行干預(yù)以探討氧化應(yīng)激在高FFA血癥所誘導(dǎo)的外周胰島素抵抗中的作用及可能的機(jī)理。

2、研究方法：正常6周齡SD大鼠18只，隨機(jī)分為3組。實(shí)驗(yàn)組給予輸注20％脂肪乳及肝素；干預(yù)組在輸注脂肪乳及肝素的同時(shí)輸注還原性谷胱甘肽；對照組給予生理鹽水輸注。輸液6小時(shí)后，進(jìn)行正常血糖高胰島素鉗夾試驗(yàn)，計(jì)算各組葡萄糖輸注率(GIR)。在輸液前及輸液后取血測定FFA濃度，并進(jìn)行血漿和紅細(xì)胞GSH／GSSG比值檢測。 研究結(jié)果：1、實(shí)驗(yàn)組輸注脂肪乳后血漿FFA水平較輸液前明顯升高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對照組輸液前后FFA水平無明顯變

3、化；干預(yù)組輸液后FFA水平升高，但明顯低于實(shí)驗(yàn)組輸液后血漿FFA水平。2、試驗(yàn)組GIR明顯低于對照組，而干預(yù)組GIR介于兩組之間。3、實(shí)驗(yàn)組血漿及紅細(xì)胞內(nèi)GSH／GSSG比值輸液后明顯下降；干預(yù)組血漿中該比值亦明顯下降；，但紅細(xì)胞中該比值卻無明顯變化；對照組輸液前后血漿及紅細(xì)胞中該比值無明顯變化。4、相關(guān)分析提示：GIR與紅細(xì)胞內(nèi)GSH／GSSG比值呈正相關(guān)。 結(jié)論：本研究證實(shí)外源性升高FFA血漿濃度可導(dǎo)致紅細(xì)胞葡萄糖代謝的磷酸

4、戊糖障礙，使GSH生成減少，由于GSH是機(jī)體滅活ROS的最終環(huán)節(jié)，所以高FFA血癥能損傷機(jī)體抗氧化機(jī)能，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。同時(shí)證實(shí)機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng)是高FFA血癥所致外周胰島素抵抗的潛在機(jī)制之一。GSH改善高FFA血癥所致的外周胰島素抵抗，可能是通過增強(qiáng)細(xì)胞對FFA的代謝能力，降低血漿：FFA水平而實(shí)現(xiàn)的。 第二部分 血漿游離脂肪酸水平(FFAs)對S-D大鼠主動脈NADPH氧化酶P47-phOX基因轉(zhuǎn)錄及翻譯作用及其機(jī)制的研究

5、 研究目的：血漿游離脂肪酸水平升高是代謝綜合征特征性病理改變。已證明血漿FFA水平升高能導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激改變，并誘導(dǎo)胰島素抵抗的產(chǎn)生。NADPH氧化酶是血管局部重要的活性氧(ROS)產(chǎn)生源，該酶的活化是動脈粥樣硬化產(chǎn)生與發(fā)展的重要致病因素，本研究旨在研究FFA對大鼠主動脈局部NADPH氧化酶P47．phox亞基基因轉(zhuǎn)錄與翻譯誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。 研究方法：以正常6周齡體重200克左右雄性S-D大鼠為研究對象。實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)組

6、(每組12只)：對照組(NC組)從頸靜脈輸注生理鹽水1.1ml／h；實(shí)驗(yàn)組(FFA組)輸注脂肪乳及肝素；干預(yù)組(FFA+GSH組)輸注脂肪乳及肝素同時(shí)給與GSH。每組實(shí)驗(yàn)大鼠按輸液時(shí)間分為6h、12h、18h、24h亞組。輸液前后取血分別測定血漿FFA水平及GSH／GSSG比值。18h亞組輸液結(jié)束后，處死大鼠取主動脈弓以下胸主動脈①作血管局部PKC活性檢測；②提取RNA作實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測NADPH氧化酶P-47phox亞基基

7、因的轉(zhuǎn)錄水平，③同時(shí)將內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞勻漿后經(jīng)western blot檢測P-phox47亞基的蛋白表達(dá)。④行超聲多普勒檢測股動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能和非內(nèi)皮依賴性血管舒張功能檢測。 研究結(jié)果：FFA組輸液6小時(shí)后血漿FFA水平較輸液前明顯增加，逐步延長輸液至24小時(shí)其血漿濃度無明顯變化；血漿GSH／GSSG比值于輸液后逐步下降，在輸注18小時(shí)后降至最低值。而NC組輸注生理鹽水前后血漿FFA濃度與GSH／GSSG比值均無明

8、顯變化。在FFA+GSH組中，輸注GSH從6小時(shí)起就顯示出能明顯降低輸注脂肪乳所導(dǎo)致的FFA．增高趨勢，在輸液18小時(shí)后與FFA組比較血漿FFA水平差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且血漿GSH／GSSG比值下降的趨勢也得到抑制。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測，NADPH氧化酶P-47phox亞基基因轉(zhuǎn)錄在FFA組中于輸液后6小時(shí)開始增加，到18小時(shí)達(dá)到高峰，其相對拷貝數(shù)較對照組組明顯增加約4倍，而NC組該基因轉(zhuǎn)錄輸液前后無明顯變化。FFA組中該基因轉(zhuǎn)

9、錄增加趨勢，在FFA+GSH組中受到明顯抑制，輸液18h后該基因拷貝數(shù)約是FFA組的1／2。同樣在western blot實(shí)驗(yàn)中，于輸液18h檢測到FFA組血管局部NADPH氧化酶P-47phox亞基表達(dá)明顯增加，而在FFA+GSH組中該基因表達(dá)增強(qiáng)趨勢被抑制。NADPH氧化酶P-47phox亞基轉(zhuǎn)錄與翻譯激活與血漿GSH／GSSG比值下降具有相關(guān)性變化趨勢。超聲多普勒檢測顯示：FFA組內(nèi)皮依賴性血管舒張功能較NC組明顯降低，而FFA+

10、GSH組內(nèi)皮依賴性血管舒張功能較FFA組顯著改善。非內(nèi)皮依賴性血管舒張功能三組間無差別。 研究結(jié)論：外源性升高血漿FFA水平能誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)血管局部NADPH氧化酶P-47phox亞基基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，加重血管局部氧化應(yīng)激損傷，產(chǎn)生病理損傷的疊加作用。阻斷高FFA血癥導(dǎo)致的氧化應(yīng)激能抑制主動脈NADPH氧化酶表達(dá)，部分恢復(fù)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，提示高FFA血癥導(dǎo)致血管功能損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)。 第三部分 黃芪

11、、川芎小復(fù)方制劑改善高脂喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗及緩解主動脈局部氧化性應(yīng)激的藥理作用及其機(jī)制研究 研究目的：研究黃芪、川芎小復(fù)方制劑對高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠胰島素敏感性，血脂及FFA水平，氧化應(yīng)激程度，以及主動脈NADPH氧化酶p47-phox亞基的基因轉(zhuǎn)錄與翻譯水平的影響，以探討我國傳統(tǒng)中藥在改善胰島素抵抗及機(jī)體和血管局部氧化應(yīng)激程度的藥理作用及可能的機(jī)制。 研究方法：3-4周齡的雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為3組。對照組12

12、只(NC組)，給與正常飼料喂養(yǎng)，并于飼養(yǎng)4周后每日根據(jù)體重灌胃生理鹽水(1ml／100g)；高脂喂養(yǎng)組12只(F組)，高脂飼料喂養(yǎng)，于4周后根據(jù)體重每日灌胃生理鹽水；中藥干預(yù)組12只(Ⅰ)，高脂飼料喂養(yǎng)，于4周后根據(jù)體重每日灌胃黃芪、)川芎小復(fù)方制劑。在喂養(yǎng)的最初4周結(jié)束后每組隨機(jī)抽選3只大鼠作正血糖高胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)，評價(jià)高脂飼料對大鼠胰島素敏感性的影響。在灌胃12周(飼養(yǎng)16周)后，每組再隨機(jī)抽取3只大鼠進(jìn)行胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)。處死大鼠，

13、①測定其腹脂重及腹脂／體重比；②采血測定血清生化指標(biāo)(甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、游離脂肪酸、空腹血糖及胰島素)；③測定血漿氧化應(yīng)激指標(biāo)：化學(xué)比色法測定丙二醛(MDA)，高效液相法測定還原型谷胱甘肽(GSH)及氧化型谷胱甘肽(GSSG)；④采用實(shí)時(shí)熒光半定量PCR技術(shù)檢測大鼠在主動脈內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞NADPH氧化酶p47-phox亞基mRNA水平；⑤采用westem blot及免疫組化技術(shù)檢測大鼠主動脈p47-phox亞基蛋白表達(dá)

14、水平。 研究結(jié)果：①F組大鼠腹脂／體重比較NC組增加而I組該比值較F組明顯降低，與NC組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而空腹血糖及胰島素水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②F組大鼠血漿TC、TG、FFA水平均較NC組增加。I組大鼠與F組相比較血漿TG水平明顯下降；血漿FFA水平亦有所下降，差別接近統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TC水平稍低于與F組，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③高脂喂養(yǎng)4周后，正血糖高胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)顯示F組GIR值較NC組降低。喂養(yǎng)16周后F組大鼠GIR較N

15、C組明顯降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；I組大鼠GIR值介于NC組與F組之間，其與F組GIR值差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④高脂組大鼠血漿MDA水平明顯高于NC組大鼠，而GSH／GSSG比值明顯降低。I大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)較F組改善，MDA水平較高脂組降低，GSH／GSSG比值增高。OF組大鼠主動脈局部p47-phox亞基基因轉(zhuǎn)錄均較NC組增加，而在I組這種轉(zhuǎn)錄增加的趨勢明顯被抑制，F(xiàn)組與I組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot結(jié)果顯示：F組大鼠