SrTRAIL的表達(dá)與DR5單抗的人源化改造.pdf

1、TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)是屬于TNF超家族的二型跨膜蛋白，在正常人體的器官和組織中廣泛表達(dá)。它能夠引起包括腫瘤細(xì)胞及一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋亡。TRAIL和TNFa及FasL有非常高的同源性。但是TNFa及FasL分別因?yàn)槟軌蛞鹬旅缘难装Y反應(yīng)，導(dǎo)致膿毒性休克癥和引起致死性肝衰竭而限制了其在臨床上的應(yīng)用。TRAIL由于能夠選擇性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而在腫瘤生物治療上有廣泛的應(yīng)用前景

2、。TRAIL也能和傳統(tǒng)的放化療起到協(xié)同增強(qiáng)的效應(yīng)。但是有報(bào)道稱不同形式的重組TRAlL會在抗腫瘤效應(yīng)和細(xì)胞毒性上有所不同。所以人們一方面在繼續(xù)關(guān)注TRAIL的安全性，另一方面也在積極的尋找TRAIL的替代品。而抗DR4、DR5單抗由于也能夠通過和死亡受體結(jié)合而向下傳遞凋亡信號，最終引起靶細(xì)胞的凋亡而成為理想的候選者。自2001年TRA-8(抗DR5單抗)面世以來，就由于其良好的抗腫瘤活性而且對正常組織細(xì)胞沒有毒性給人們很大的信心。近年來

3、對于抗DR4，DR5的抗體，國內(nèi)外進(jìn)行了很多的研究，但是至今還沒有上市的藥物。本研究就是一方面通過分子生物學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)兩種不同形式的人源TRAIL胞外段結(jié)構(gòu)域(114-281aa)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，一種是在其氨基末端加上多聚組氨酸標(biāo)簽和S-Tag(TRAIL-His)；另一種是不加任何的外源標(biāo)簽蛋白(TRAIL-NH)，并初步比較了兩種TRAIL蛋白的功能。RT-PCR法從人外周血單個核細(xì)胞中擴(kuò)增TRAI L胞外段基因，克隆入p

4、GE M-T-Easy載體，DNA序列測定鑒定正確性。然后分別將其克隆入原核表達(dá)載體pET-30a(His)，pET-28a(NH)。采用E.coli BL21(DE3)表達(dá)，Ni親和柱和離子柱分離純化目的蛋白。SDS-PAGE和Western blot鑒定原核表達(dá)產(chǎn)物。MTT法、PI染色法及瑞氏-姬姆薩染色法觀察TRAlL-His，TRAIL-NH蛋白的生物學(xué)活性。所表達(dá)目的蛋白分子量與預(yù)期蛋白分子量相一致，該蛋白可以與抗TRAIL多

5、克隆抗體及抗組氨酸標(biāo)簽抗體反應(yīng)，并可抑制人淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡。另一方面對本室獲得的一株抗DR5單抗mDRA6進(jìn)行人源化改造以擴(kuò)大其應(yīng)用前景。采用分子生物學(xué)的方法首先對抗體進(jìn)行嵌合化改造。首先用RT-PCR法從分泌mDRA6的雜交瘤中釣取可變區(qū)基因，克隆入pGEM-T-Easy載體，經(jīng)測序后，在BLAST上進(jìn)行比對證實(shí)為新的鼠源抗體。然后分別構(gòu)建嵌合抗體c-m DRA6的輕重鏈真核表達(dá)載體VHex