Cyclin E2在白血病中的表達(dá)及其反義脫氧寡核苷酸對(duì)K562細(xì)胞增殖的調(diào)控作用.pdf

1、目的：幾乎所有的cyclins都可能作為一種原癌基因被激活后在腫瘤中發(fā)揮癌基因的作用。Cyclin E2作為cyclin家族新發(fā)現(xiàn)的成員之一，是基因編碼一個(gè)與cyclin E1高度同源的404個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。Cyclin E2/CDK2復(fù)合體相關(guān)的激酶活性受到細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，在G1/S期轉(zhuǎn)化時(shí)達(dá)到峰值。在哺乳動(dòng)物cyclin E2的過表達(dá)加速G1期進(jìn)程，表明cyclin E2可能在G1期起限制點(diǎn)作用。Cyclin E1主要在大多數(shù)

2、增殖性正常細(xì)胞和致腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)，而cyclin E2的水平在非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中幾乎難以檢測到，在腫瘤源性細(xì)胞中顯著升高。目前國內(nèi)外部分學(xué)者研究已經(jīng)證明cyclin E2在多種實(shí)體腫瘤組織中(如肺癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、腦癌等)高表達(dá)。關(guān)于cyclin E2在白血病患者中的表達(dá)及其作用國內(nèi)外的報(bào)道不多，我們的前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cyclin E2在白血病細(xì)胞中有高表達(dá)并且與臨床療效有明顯的負(fù)相關(guān)性，是白血病細(xì)胞增殖的一種新的指標(biāo)，可

3、能對(duì)判斷預(yù)后有幫助。故此希望通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確cyclin E2在白血病發(fā)病過程中所起的作用，以及與CDK2的關(guān)系，了解其表達(dá)異常與白血病患者的分型、分期及預(yù)后(復(fù)發(fā)、耐藥、緩解)的關(guān)系；希望為臨床診斷、化療藥物的選擇及判斷預(yù)后提供幫助。 反義核酸技術(shù)是利用反義核酸片段抑制或封閉目的基因的表達(dá)，達(dá)到基因?qū)蛑委熌[瘤的目的。Cyclin E2在白血病細(xì)胞中有高表達(dá)且和臨床預(yù)后相關(guān)，我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一個(gè)特異的cyclin E2反義脫氧

4、寡核苷酸(antisenseoligodexynucleotide,ASON)封閉cyclin E2的表達(dá)，探討cyclin.E2 ASON對(duì)體外培養(yǎng)的白血病細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控作用，并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染提高細(xì)胞內(nèi)攝取反義核酸的濃度，從分子水平揭示cyclin E2對(duì)白血病細(xì)胞惡性增殖的作用，希望為白血病的基因治療提供一個(gè)新的思路。 方法：本研究的研究對(duì)象包括70例急性白血病患者(包括41例新近診斷急性白血病患者、10例復(fù)發(fā)患者和

5、19例完全緩解期患者)。14名健康人為正常對(duì)照。應(yīng)用半定量RT-PCR方法檢測骨髓或外周血單個(gè)核細(xì)胞cyclin E2和CDK2 mRNA表達(dá)水平。采用反義技術(shù)將cyclin E2特異的ASON與K562細(xì)胞共培養(yǎng)。用MTT法檢測轉(zhuǎn)染ASON和脂質(zhì)體lipofectamine<'TM>2000后的細(xì)胞活力，RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞cyclin E2 mRNA表達(dá)水平及流式細(xì)胞術(shù)和形態(tài)學(xué)觀察檢測細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： 1.

6、Cyclin E2和CDK2 mRNA在AL中的表達(dá)水平：41例初治AL患者組cyclin E2 mRNA陽性表達(dá)率為70.7％，表達(dá)水平為(M=51)，正常對(duì)照組不表達(dá),AL組陽性率和表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)。急性髓系白血病(AML)患者組(71％，M=32.63)與急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL')患者組(70％，M=33.95)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(P值均小于0

7、.01.)。復(fù)發(fā)難治組陽性表達(dá)率為70％，表達(dá)水平(M=53.6)高于正常對(duì)照組(P<0.05)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與初治組和CR組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。完全緩解組陽性表達(dá)率和表達(dá)水平為(47.4％，M=34.89)低于初治AL組(P<0.01，P<0.05)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高于正常對(duì)照組，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在41例AL，患者初治組CDK2mRNA陽性表達(dá)率78.1％，表達(dá)水平為(M=53.83)，明顯高

8、于正常對(duì)照組(28.6％，M=20.79)，(P<0.01,P<0.05)。復(fù)發(fā)難治組陽性表達(dá)率為60％，表達(dá)水平(M=39.95)，明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01,P<0.05)，與AL初治組和CR組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。完全緩解組陽性表達(dá)率為63.2％，表達(dá)水平為(M=36.37)低于AL初治組(P<0.05)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常對(duì)照組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 2.對(duì)41例新近診斷AL患者進(jìn)

9、行療效評(píng)估，29例cyclin E2mRNA陽性表達(dá)患者中14例獲完全緩解，完全緩解率48.3％；12例cyelin E2 mRNA陰性表達(dá)患者中11例獲完全緩解，完全緩解率91.7％，進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，兩組緩解率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x<'2>=5.016，P<0.05)。對(duì)臨床緩解患者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)cyclin E2陽性患者復(fù)發(fā)率高，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3.Pearson相關(guān)分析表明在70例.AL患者中cycl

10、in E2 mRNA表達(dá)水平與CDK2mRNA：表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.5097，P<0.01)。在41例初治AL患者中cyclin E2和CDK2雙陽性患者23例，雙陽性率為56.1％，其中CR9例，緩解率為38.1％；cyclin E2和CDK2雙陰性患者8例，CR7例，緩解率為87.5％，cyclin E2和CDK2雙陽性患者緩解率低于cyclin E2和CDK2雙陰性患者(P<0.05)。 4.Cyclin E2特異的

11、ASON組與SON組、Random ASON組及空白對(duì)照組相比，能顯著地抑制cyclin E2 mRNA水平的表達(dá)(P<0.01)；白血病細(xì)胞的生長明顯受抑制(P<0.01)，細(xì)胞凋亡明顯增加。結(jié)果表明反義脫氧寡核苷酸能有效地抑制K562細(xì)胞的增殖，抑制K562細(xì)胞cyclin E2 mRNA表達(dá)上調(diào)，并顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 結(jié)論： 1.AL初治組和復(fù)發(fā)組患者cyclin E2和CDK2 mRNA.的表達(dá)水平明顯高于

12、正常對(duì)照組，初治組表達(dá)水平明顯高于完全緩解組。復(fù)發(fā)組表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，但與初治組、緩解組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示cyclin E2和CDK2在AL中過度表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控而異常增生，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展 2.評(píng)估AL效發(fā)現(xiàn)：cyclin E2 mRNA陽性表達(dá)組其完全緩解率低于cyclin E2陰性表達(dá)組，cyelin E2陽性表達(dá)的患者治療效果差。Cyclin E2可以作為判斷急性白血病預(yù)后的指標(biāo)。 3.在.

13、AL中cyclin E2/CDK2 mRNA.的表達(dá)水平明顯升高，且呈正相關(guān)。Cyclin E2/CDK2雙表達(dá)患者CR低，治療效果差。提示cyclin E2和CDK2在AL的發(fā)病機(jī)制中起協(xié)同作用，共同參與了急性白血病的發(fā)生與發(fā)展。CyclinE2/CDK2雙表達(dá)者的白血病細(xì)胞惡性程度高，細(xì)胞增殖旺盛。 4.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染cyclin E2的反義寡核苷酸能夠有效地抑制K562細(xì)胞cyclin E2 mRNA的表達(dá)，同時(shí)，對(duì)白血病細(xì)胞