肺癌中TSG101蛋白與Notch3受體表達(dá)的相關(guān)性.pdf

1、前言： TSG101(Tumor Susceptibility Gene101)蛋白近年被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤均有關(guān)，且常被檢測(cè)出有異常剪切子存在，但其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用尚未完全明確?？墒谴说鞍鬃鳛閮?nèi)吞分選通路的重要因子，可以影響多種蛋白的內(nèi)吞降解。一旦此通路異常，便會(huì)使內(nèi)吞的囊泡受阻于運(yùn)往溶酶體降解的途中，進(jìn)而增加蛋白被異常激活或循環(huán)再利用的幾率，造成細(xì)胞生長(zhǎng)中的信號(hào)紊亂。而Notch受體信號(hào)家族成員是利用此通路調(diào)節(jié)信號(hào)平衡

2、的典型代表，正常情況下內(nèi)吞分選過(guò)程參與調(diào)節(jié)他們?cè)诓煌瑫r(shí)間、不同空間下的信號(hào)平衡，確保細(xì)胞分化、增殖的正常進(jìn)行。有文獻(xiàn)報(bào)道果蠅中TSG101蛋白同源物的異常阻礙了Notch受體的降解，進(jìn)而信號(hào)表達(dá)增多，出現(xiàn)果蠅胚基的異常增殖。而在哺乳動(dòng)物組織中Notch受體有4種亞型，在人類許多腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有不同亞型的異常表達(dá)，且常是在信號(hào)數(shù)量上的變化。而在肺組織中Notch3亞型受體被證實(shí)是對(duì)肺組織分化、發(fā)育和損傷修復(fù)起突出作用的亞型。那么本研究旨在初

3、步探討肺癌中TSG101蛋白和Notch3受體的表達(dá)情況，及兩者表達(dá)的可能相關(guān)性。 材料與方法： 1、材料 收集65例肺癌組織(鱗癌38例，腺癌27例)，另外24例新鮮肺癌組織及26例新鮮癌旁正常肺組織取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院。 6株肺癌細(xì)胞系(SK為肺鱗癌細(xì)胞系；BE1為肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系；460為肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系；LTE和SPC為肺腺癌細(xì)胞系；446為肺小細(xì)胞癌細(xì)胞系)。 2、主要試劑和

4、來(lái)源 濃縮型鼠抗人TSG101蛋白單克隆抗體(sc-7964)，兔抗人Notch3受體多克隆抗體(sc-5593)均購(gòu)自Santa Cruz公司。 3、方法 (1)免疫組織化學(xué)技術(shù)蠟塊標(biāo)本切片后按照鏈菌素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶免疫組化法(SP法)檢測(cè)TSG101蛋白(1:200)和Notch3受體(1:200)表達(dá)。孔板爬片細(xì)胞固定、打孔后，按照SP法檢測(cè)Notch3受體(1:200)表達(dá)。以磷酸緩沖液PBS代

5、替一抗作為陰性對(duì)照。 (2)Western blot技術(shù)總蛋白從生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期收集的細(xì)胞及組織中提取。SDS-PAGE電泳，TSG101蛋白80 v恒壓4℃濕轉(zhuǎn)2 h，Notch3受體200 mA恒流4℃濕轉(zhuǎn)500 min。TBS/0.3％Tween-20/5％小牛血清室溫封閉2hrs，一抗(1:400)4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育2h。Notch3受體內(nèi)參β-actin在電泳后以切膠方式與Notch3受體所在部位分開(kāi)轉(zhuǎn)印。ECL

6、顯色，X線膠片曝光成像。 (3)抗體封閉技術(shù)癌細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，傳代3批次。無(wú)血清培養(yǎng)基1640饑餓8h后，分別不加抗體、加入與TSG101蛋白抗體同源的無(wú)關(guān)IgG作為對(duì)照，加入TSG101蛋白抗體，均孵育48 h。以Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)抗體封閉TSG101蛋白功能后，Notch3受體表達(dá)情況。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用x2檢驗(yàn)分析各組計(jì)數(shù)資料，采用S

7、pearman等級(jí)相關(guān)分析TSG101蛋白與Notch3受體表達(dá)的關(guān)系，采用t檢驗(yàn)分析Western blot圖像灰度值，細(xì)胞組化積分光密度值，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、免疫組織化學(xué)結(jié)果：TSG101蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，少量定位于細(xì)胞核。在正常肺組織中染色強(qiáng)于肺鱗癌和肺腺癌。Notch3受體主要定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核。在正常肺組織染色弱于肺鱗癌和肺腺癌。兩者表達(dá)水平均與肺癌組織分化(P<0

8、.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)明顯相關(guān)。TSG101蛋白表達(dá)與Notch3受體表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。 用TSG101蛋白抗體封閉SPC細(xì)胞中TSG101蛋白功能后Notch3受體的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示胞漿中Notch3受體染色有增強(qiáng)。 2、Western Blot結(jié)果：TSG101蛋白在癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)明顯低于正常肺組織及細(xì)胞系，Notch3受體在癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)則明顯高于正常。用TSG101蛋