分化相關(guān)基因dif14在白血病細(xì)胞K562分化中的表達(dá)及其不同異位剪接mRNA的克隆.pdf

1、白血病是人類常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，它一般發(fā)生于造血細(xì)胞分化的某個(gè)階段，表現(xiàn)為細(xì)胞分化障礙。使用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化已作為一種有效的治療手段應(yīng)用于臨床，這也成為研究白血病細(xì)胞分化機(jī)制的主要方法。但是，不同類型的白血病需要不同的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)其細(xì)胞分化，其機(jī)制也各不相同。到目前為止，誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的機(jī)制還不十分清楚，對于細(xì)胞分化機(jī)制的研究仍有待于進(jìn)一步深入。 Dif14 基因是本實(shí)驗(yàn)室于2000 年克隆并命名的新基因。我

2、們利用化合物HMBA（hexamethylene bisacetamide）誘導(dǎo)白血病細(xì)胞K562 向巨噬細(xì)胞樣分化的模型，克隆了dif14 基因，該基因GenBank accession number 為AF402318，這一研究提示dif14 基因與細(xì)胞分化相關(guān)。目前，國內(nèi)外尚未見dif14 基因在白血病細(xì)胞分化過程中作用以及其功能的研究報(bào)道。 在前期實(shí)驗(yàn)中，我們已克隆了長片斷形式dif14 基因的開放讀框序列，并克隆于pG

3、EM-7zf(+)載體中。 研究目的 檢測dif14 基因在髓系白血病細(xì)胞分化和人體多種正常組織中的表達(dá)情況，并尋找和克隆其異位剪接mRNA，為深入認(rèn)識(shí)該基因功能打下基礎(chǔ)，并期望為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)髓系白血病細(xì)胞分化機(jī)制提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1. 應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析dif14 基因的同源基因和同源蛋白，并進(jìn)行進(jìn)化分析。 2. 通過Northern blot 檢測HMBA 誘導(dǎo)前后K562 細(xì)胞中d

4、if14 mRNA 的表達(dá)變化，并分析該基因在多種組織中的表達(dá)情況。 3. 建立原核表達(dá)體系，表達(dá)并純化dif14 基因N 端蛋白，制備多克隆抗體；運(yùn)用Western blot 檢測誘導(dǎo)前后K562 細(xì)胞中dif14 蛋白的表達(dá)變化。 4. 運(yùn)用RT-PCR 方法尋找并克隆異位剪接mRNA，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)dif14基因的功能打下基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．Dif14 cDNA 編碼490a.a.的蛋白，生物信息學(xué)

5、分析提示該蛋白為九次跨膜蛋白。在多種低等生物中存在其同源基因，為進(jìn)化中相對保守的一個(gè)蛋白家族成員之一。 2．Dif14 mRNA 在HMBA 誘導(dǎo)后的K562 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，人體正常骨骼肌、腎和肝組織表達(dá)較高。并存在4.6 Kb 和2.5 Kb 兩種不同大小的表達(dá)產(chǎn)物。HMBA 誘導(dǎo)后K562 細(xì)胞向巨噬細(xì)胞樣分化后其蛋白水平表達(dá)上調(diào)。 3．克隆了dif14 基因異位剪接片斷。 結(jié)論 1． Dif14