采用RNA干擾技術(shù)抑制非小細(xì)胞肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文采用RNA干擾技術(shù)抑制非小細(xì)胞肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究姓名：張敏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：白春學(xué)20040330期為腫瘤治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：(1)建立檢測(cè)EGFR數(shù)量的方法，測(cè)定A549、SPC—A1細(xì)胞株EGFR的表達(dá)。(2)體外化學(xué)合成EGFR序列特異性雙鏈RNA(dsRNA—EGFR)，與Lipofectamine2000結(jié)合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用熒光顯微鏡、Westernblo

2、t技術(shù)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFR表達(dá)，采用Real—timePCR檢測(cè)EGFR基因水平，觀察dsRNA—EGFR／LipofectamJne2000對(duì)EGFR表達(dá)的抑制作用。(3)采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，采用ELISA法測(cè)定配體EGF含量，結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)、集落形成、刮痕實(shí)驗(yàn)、化療敏感l(wèi)i3)“析觀察抑制EGFR表達(dá)后，A549、SPCA1細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。結(jié)果：A549、SPC—A1細(xì)胞株存在EGFR高表達(dá)。dsRNA—EGFR／L

3、ipofectamine2000復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞可引發(fā)EGFR序列特異性基因沉默效應(yīng)，熒光顯微鏡下觀察、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、WesternBlot分析得到了一致的結(jié)果。對(duì)于A549細(xì)胞，與對(duì)照組比較，dsRNAEGFR組EGFR基因及蛋白水平分別下調(diào)了3704％、7131％，細(xì)胞生【丈抑制了85，O％，集落形成抑制了633％，細(xì)胞遷移能力明顯降低。細(xì)胞周期分析結(jié)果表明dsRNAEGFR組G。一G期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較對(duì)照組增加了1267％，進(jìn)入s期的

4、細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較對(duì)照組減少了656％。轉(zhuǎn)染dsRNA—EGFR后可將A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性提高約4倍。ELISA結(jié)果表明dsRNk—EGFR組培養(yǎng)液及細(xì)胞抽提蛋白Ifl的1i5F分別降低了2774％、1107％；對(duì)于SPC—A1細(xì)胞，與對(duì)照組比較，dsRNAEGFR組EGFR基因及蛋白水平分別下調(diào)了5000％、7178％，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制了783％，集落形成抑制了668％，細(xì)胞遷移能力明顯降低。細(xì)胞周期分析結(jié)果表明dsRNA—EGFR組Go

5、G，期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較對(duì)照組增加了1748％，進(jìn)入s期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較對(duì)照組減少了1920％。轉(zhuǎn)染dsRNA—EGFR后可將SPC—A1細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性提高約7倍。ELISA結(jié)果表明dsRNA—EGFR組培養(yǎng)液及細(xì)胞抽提蛋白中的EGF分別降低了4565％、2245％。結(jié)論：(1)NSCLC細(xì)胞株存在EGFR高表達(dá)。(2)dsRNA—EGFR可序列特異性下調(diào)NSCLC細(xì)胞EGFR基因水平，顯著降低EGFR蛋白表達(dá)。(3)dsRNA—EGFR通

6、過抑制EGFR表達(dá)可濕轉(zhuǎn)抑制細(xì)胞增生和細(xì)胞遷移，降低配體EGF的含量，將更多的細(xì)胞m滯任GG期，增加細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，有效逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞的惡性表型，從而為NSCLC基因治療提供了新策略。關(guān)鍵詞：表皮生睦因子受體；RNA干擾：小干擾RNA；雙鏈RNA；非小細(xì)胞肺癌第三部分RNA干擾技術(shù)抑制NSCLC細(xì)胞EGFR表達(dá)的在體實(shí)驗(yàn)研究目的：探討采用體外化學(xué)合成的小干擾RNA(siRNA)結(jié)合陽(yáng)離子脂質(zhì)體是否能有效在體轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞，以