經(jīng)皮穿刺CPC-FG-OM復(fù)合材料股骨頭填充聯(lián)合hBMSCs移植治療股骨頭壞死的初步研究.pdf

1、第一章自體血清培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞的可行性評估
　　 目的:
　　 胎牛血清體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細胞增加體內(nèi)移植的風險，限制其臨床應(yīng)用。本部分實驗旨在探討自體血清體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞的可行性。
　　 方法:
　　 全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、純化人骨髓間充質(zhì)干原代細胞，取第三代細胞按加入培養(yǎng)血清的不同分為胎牛血清培養(yǎng)組和自體血清培養(yǎng)組。倒置相差顯微鏡觀察兩組培養(yǎng)細胞的生長情況;使用MTT法測定兩組培

2、養(yǎng)傳代第3代細胞和第5代細胞的增殖情況，繪制細胞增殖曲線;取兩組培養(yǎng)傳代第3代細胞行成軟骨細胞、成骨細胞及成脂肪細胞誘導(dǎo)分化，并分別對成軟骨細胞行甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原染色;對成骨細胞行堿性磷酸酶(ALP)染色、VonKossa染色;對成脂肪細胞行油紅O染色，并計算兩組細胞誘導(dǎo)分化陽性率;取自體血清培養(yǎng)組傳代第5代細胞行流式細胞儀測定鑒定細胞表面CD34、CD44、CD45、CD90抗原表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 倒

3、置相差顯微鏡下觀察全骨髓貼壁法分離純化的原代細胞形態(tài)均一，呈長梭形，兩組培養(yǎng)細胞近融合狀態(tài)均呈漩渦樣同向生長特征;MTT測定兩組培養(yǎng)第3代及第5代細胞均具備良好的生長增殖潛能，第3-6d是增殖對數(shù)增長期，兩組細胞增殖無統(tǒng)計學差異;兩組培養(yǎng)第3代細胞均能在特定誘導(dǎo)環(huán)境下向成軟骨細胞、成骨細胞及成脂肪細胞分化，成軟骨細胞經(jīng)甲苯胺藍染成藍紫色，Ⅱ型膠原染成黃色;成骨細胞堿性磷酸酶染色(ALP)陽性，VonKossa鈣結(jié)節(jié)染成黑色;成脂肪細胞內(nèi)

4、經(jīng)油紅O染成紅色脂滴，兩組誘導(dǎo)分化細胞陽性率無統(tǒng)計學差異;自體血清培養(yǎng)組第5代細胞經(jīng)流式細胞儀鑒定細胞表面不表達CD34、CD45，而表達CD44、CD90。
　　 結(jié)論:
　　 全骨髓貼壁培養(yǎng)法操作簡單，細胞純化率高;自體血清培養(yǎng)組細胞保持了骨髓間充質(zhì)干細胞典型的生長特征、增殖以及誘導(dǎo)分化潛能;自體血清培養(yǎng)組細胞表面不表達造血干細胞表面抗原，而表達骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗原，符合骨髓間充質(zhì)干細胞特征。
　　 第二

5、章 CPC/FG/OM復(fù)合材料的研制及理學性質(zhì)測定
　　 目的:
　　 股骨頭壞死是臨床治療上頗為棘手的問題之一。有研究表明壞死股骨頭軟骨下骨板的支撐是治療股骨頭壞死的關(guān)鍵因素。磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）材料是一種兼?zhèn)湫迯?fù)與成型的骨組織修復(fù)材料，具備自固化與骨傳導(dǎo)特性。但是由于材料本身的缺陷存在抗壓強度低，無骨誘導(dǎo)活性等缺點，限制了其在人體負重區(qū)域的臨床應(yīng)用。纖維蛋白膠（fi

6、brin glue，F(xiàn)G）是臨床上廣泛應(yīng)用的粘合劑，與CPC復(fù)合能夠利用其粘性增加CPC的抗壓強度。成骨誘導(dǎo)劑(osteogenesis medium，OM)已被證實對骨髓間充質(zhì)干細胞有著誘導(dǎo)成骨分化的作用。本部分實驗旨在研制一種新型的適用于治療股骨頭壞死的填充材料—CPC/FG/OM復(fù)合材料，以期復(fù)合材料即能夠保留單純CPC材料自固化及優(yōu)良骨傳導(dǎo)性的優(yōu)點，又能夠通過加入FG增強材料的抗壓強度以滿足人體負重區(qū)域抗壓強度要求以及加入OM增

7、加材料的成骨誘導(dǎo)活性以改善壞死股骨頭內(nèi)的成骨內(nèi)環(huán)境。
　　 方法:
　　 將OM加入FG中制備FG/OM溶液，按照3∶1的粉末/液體比例配置CPC/FG/OM復(fù)合材料，按照相同的粉末/液體比值配置CPC/FG復(fù)合材料及CPC材料作為兩組對照組。對三組材料進行掃描電鏡觀察材料表面結(jié)構(gòu);XRD晶體分析;凝固時間（吉爾摩針法）、抗壓強度、彈性模量（MTS S10力學性能實驗機測試）以及孔隙率的測定（阿基米德法）。
　　

8、 結(jié)果:
　　 三組材料掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)單純CPC材料表面孔隙分布均勻，孔隙較小，而CPC/FG及CPC/FG/OM兩種復(fù)合材料表面孔隙分布不均勻，孔隙尺寸大;XRD分析顯示三種材料的XRD曲線與羥基磷灰石相似;CPC/FG及CPC/FG/OM兩種材料初凝時間[(6.8±0.5)min，(7.28±0.6)min]明顯長于CPC材料[(3.38±0.4)min]，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，三種材料終凝時間差異無統(tǒng)計學差異

9、(P＞0.05); CPC/FG及CPC/FG/OM兩種材料抗壓強度及彈性模量[(8.94±0.5)MPa，(9.1±0.4) MPa;(2.73±0.07)GPa，(2.846±0.1)GPa]明顯高于CPC材料組[(5.08±0.5)MPa，(1.064±0.14)GPa]，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);CPC/FG及CPC/FG/OM兩種材料孔隙率[（38.64±1.5）％，（37.9±1.4）％]明顯低于CPC材料組[（48

10、.82±8.2）％]，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 三種材料晶體相與羥基磷灰石一致，證實體內(nèi)降解產(chǎn)物與人體骨骼無機成分相同;CPC/FG/OM復(fù)合材料中OM的加入沒有影響其理學性質(zhì):凝固時間滿足臨床經(jīng)皮穿刺的可注射性要求;抗壓強度及彈性模量與CPC/FG復(fù)合材料相仿，明顯高于CPC材料，達到壞死股骨頭軟骨下骨板的填充材料抗壓強度要求;孔隙率與CPC/FG復(fù)合材料相仿，明顯低于CPC材料，但是由于