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文檔簡介
1、目的:采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態(tài)性(RT-PCR—RFLP)方法,研究大腸癌中IGF2基因印跡狀態(tài)的改變,分析印跡基因IGF2的印跡丟失與大腸癌的關(guān)系,探討IGF2的印跡丟失在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的印跡調(diào)控機制,并探討其與大腸癌生物學行為的關(guān)系。 方法:收集56例人原發(fā)性大腸癌患者原發(fā)灶和癌旁組織標本。1.組織DNA/RNA提取和鑒定取約100mg凍存組織標本,常規(guī)用10%SDS/氯仿/乙醇法提取DNA。紫外分光光
2、度法測定A260/A280,DNA樣品的比值為1.8—2.0為最佳。TRIZOL試劑/氯仿/異丙醇/乙醇提取RNA。2.IGF2第九外顯子內(nèi)有一 ApaⅠ多態(tài)酶切位點,只有當標本的基因型為雜合狀態(tài)時,才能為區(qū)分兩條等位基因的表達產(chǎn)物提供信息。3.選擇雜合子標本,對其RT-PCR產(chǎn)物用相同的內(nèi)切酶切,酶切后經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。如果IGF2的基因表達呈雙等位基因表達型(AB型)即292bp和256bp同時存在,說明發(fā)生了印跡丟
3、失。如果只出現(xiàn)292bp條帶(A型)或出現(xiàn)256bp(B型),說明轉(zhuǎn)錄來自于一條等位基因,即維持正常印跡狀態(tài)。4.采用Fisher確切概率法分析IGF2印跡丟失與臨床病理資料的相關(guān)性。所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0軟件進行分析。 結(jié)果:1.PCR產(chǎn)物檢測。產(chǎn)物為292bp,通過對PCR反應液的瓊脂糖凝膠電泳后圖像分析,以成功合成產(chǎn)物。2.雜合標本的篩選。56例待測標本中,共篩出29例IGF2雜合標本,其陽性率為51.79%(29/
4、56)。其中雜合丟失1例。3.印跡狀態(tài)檢測。雜合標本的正常組織反轉(zhuǎn)錄的cDNA,經(jīng)PCR后,再經(jīng)ApaⅠ酶切后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,在28例無雜合性丟失的雜合子中,有17例(60.71%)腫瘤組織發(fā)生了LOI。在這17例腫瘤組織對應的癌旁組織中,有14例(82.35%)發(fā)生了LOI,另外3例沒有LOI。腫瘤組織和癌旁組織均無印跡丟失的有7例(25%)。4.IGF2的LOI與臨床病理特征的關(guān)系。28例有意義的樣本中,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有13
5、人,發(fā)生LOI的有11人;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的15人,發(fā)生LOI的有6人。IGF2的LOI與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(P<0.05),與腫瘤患者的年齡,性別,腫瘤發(fā)生的部位均無關(guān)(P>0.05)。 結(jié)論:大腸癌組織和癌旁正常組織均出現(xiàn)LOI,發(fā)生LOI的腫瘤組織病例中癌旁組織LOI發(fā)生率明顯高于未發(fā)生LOI的腫瘤組織病例中癌旁組織出現(xiàn)LOI的發(fā)生率。兩者相比有顯著性差異(P<0.05)。IGF2基因的LOI與臨床病理學特征(年齡,性別,發(fā)
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