現(xiàn)代分離分析技術(shù)在板藍(lán)根成分分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、本論文針對(duì)板藍(lán)根及其有效成分展開(kāi)了一系列藥物分析學(xué)方面的研究。采用現(xiàn)代分離分析技術(shù)依次建立和發(fā)展了板藍(lán)根脂溶性部位、板藍(lán)根水溶性部位、板藍(lán)根氨基酸、板藍(lán)根多糖、板藍(lán)根揮發(fā)性成分以及板藍(lán)根藥材的分析手段，試探性地提出了新的分析理論或者方法，探索出了針對(duì)板藍(lán)根不同性質(zhì)目標(biāo)組分的合理定性定量研究途徑。在樣品前處理和樣品分析技術(shù)兩個(gè)方面引入了一些新方法新技術(shù)，對(duì)一些現(xiàn)行方法進(jìn)行了改進(jìn)，拓寬了這些方法的應(yīng)用領(lǐng)域，也獲得了一系列創(chuàng)新性的研究成果。本

2、論文的主要研究如下：
　　 第一章，我們依次從板藍(lán)根的化學(xué)成分、板藍(lán)根的藥理作用和臨床應(yīng)用、板藍(lán)根的提取方法、板藍(lán)根的分析技術(shù)，比較全面地概述了板藍(lán)根的研究現(xiàn)狀。板藍(lán)根的現(xiàn)行分析手段不能很好地解決中藥板藍(lán)根質(zhì)量控制方面存在的問(wèn)題，更不用提及板藍(lán)根制劑的分析研究以及該藥物的臨床用藥安全性等方面。因此，針對(duì)板藍(lán)根藥材及其活性成分，采用現(xiàn)代分離分析技術(shù)，開(kāi)展系統(tǒng)性研究是十分必要的。本課題研究也正是在這樣的時(shí)代要求下開(kāi)始此次研究。

3、>　　 第二章，以板藍(lán)根脂溶性部位活性成分為研究對(duì)象，開(kāi)展了以下幾個(gè)方面的研究：1)建立了紅外光輔助提取法(IRAE)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化法(RSM)優(yōu)化提取色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅的條件，確定了紅外光輔助提取的最佳條件。紅外光輔助提取法較傳統(tǒng)提取方法而言，十分經(jīng)濟(jì)、方便、有效、而且不限制提取溶劑種類，表現(xiàn)出良好的提取效率。2)首次建立了11個(gè)產(chǎn)地板藍(lán)根脂溶性部位的改良多波長(zhǎng)組合指紋圖譜，擬合出24個(gè)共有峰的參照指紋色譜圖，并確定了其中7個(gè)色譜

4、峰。不同產(chǎn)地板藍(lán)根的分層群聚分析(HcA)和主成份分析(PCA)結(jié)果表明采收時(shí)期和耕種地理位置對(duì)板藍(lán)根藥材質(zhì)量都存在影響。3)首次建立了基于苯甲酸一測(cè)多評(píng)和各組分最佳檢測(cè)波長(zhǎng)液相色譜技術(shù)(Benzoic acid-based QAMS/RODWs-HPLC)，該方法能夠克服傳統(tǒng)色譜分析依賴多種對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品展開(kāi)定性定量分析、檢測(cè)器靈敏度較低等缺點(diǎn)。將單一對(duì)照品苯甲酸作為參照，借助基于苯甲酸的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)校正因子，運(yùn)用各組分最佳檢測(cè)波長(zhǎng)

5、液相色譜法在230，236，245和275 nm紫外檢測(cè)波長(zhǎng)下，有選擇地、較高靈敏度地分析待測(cè)樣品中的乙酰水楊酸，苯甲酸，水楊酸，鄰氨基苯甲酸和丁香酸。通過(guò)建立相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，充分地利用和挖掘Benzoic acid-based QAMS/RODWs-HPLC方法。4)我們課題組開(kāi)發(fā)了智能在線固相萃取與多級(jí)柱切換，基于苯甲酸一測(cè)多評(píng)和各組分最佳檢測(cè)波長(zhǎng)液相色譜聯(lián)用技術(shù)(Automated on-line SPE/Multi-stagec

6、olumn-switching and Benzoic acid-based QAMS/RODws-HPLC)，該聯(lián)用技術(shù)是一種新穎的、有效的分析血漿樣品中丁香酸，苯甲酸和水楊酸的方法。這些研究成果分別發(fā)表在Journal of Separation Science(2011，34，1123-1132.)、ActaChromatographica(In Press)、Chromatographia(In Press)雜志。
　　

7、 第三章，以板藍(lán)根水溶性部位活性成分為研究對(duì)象，開(kāi)展了以下幾個(gè)方面的研究：1)我們首先引入紅外光輔助提取技術(shù)(IRAE)這一新穎的前處理技術(shù)分析板藍(lán)根藥材中腺苷，確定了最優(yōu)前處理?xiàng)l件：260W紅外光功率，45min紅外光輻射時(shí)間，1:20固液比和40％N乙醇水溶液濃度。同時(shí)建立了一種針對(duì)板藍(lán)根中腺苷的簡(jiǎn)單液相色譜法。紅外光輔助提取技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、快速、環(huán)保、低成本的提取分離方法，在中藥質(zhì)量控制中具有比較好的應(yīng)用前景。2)我們運(yùn)用ESI-

8、MS質(zhì)譜法，系統(tǒng)研究了板藍(lán)根水溶性部位化合物成分，最終確定了該部位中胞苷，尿苷，鳥(niǎo)苷，(R，S)-告依春和腺苷五個(gè)主要水溶性化合物。3)首次建立這些化合物的各組分最佳檢測(cè)波長(zhǎng)液相色譜分析方法，結(jié)合優(yōu)化的微波輔助提取法(400W微波功率，1:80固液比和10min輻射時(shí)間)對(duì)板藍(lán)根水提取中五種主要化合物進(jìn)行定量分析。各組分最佳檢測(cè)波長(zhǎng)液相色譜(RODWs-HPLC)表現(xiàn)出非常寬的線性濃度范圍，很好的靈敏度和比較直觀的三維立體效果。這些研究

9、成果分別發(fā)表在Chromatographia(2010，72，719-724.)、Journal of the Chinese Chemical Society(2012，59，51-59.)雜志。
　　 第四章，建立了一種簡(jiǎn)單、實(shí)用的分析20種常見(jiàn)氨基酸的9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-C1)柱前衍生化液相分析方法，確定了20種氨基酸的線性回歸方程，達(dá)到幾十納克級(jí)的檢測(cè)限。首次將該方法運(yùn)用到不同產(chǎn)地板藍(lán)根氨基酸的分析中，結(jié)果：板藍(lán)

10、根氨基酸主要是脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、蛋氨酸(Met)和纈氨酸(Val)，11個(gè)產(chǎn)地板藍(lán)根含有四種氨基酸的總量為13.32～19.16 mg/g(板藍(lán)根生藥)。擬合出標(biāo)準(zhǔn)化板藍(lán)根氨基酸的9-氯甲酸芴甲酯柱前衍生化色譜圖。該研究成果發(fā)表在Journal of the Chinese Chemical Society(2011，58，509-515.)雜志。
　　 第五章，采用了微波輔助提取，PMP柱前衍生化法分析了板藍(lán)

11、根多糖。建立了一種PMP柱前衍生高效液相色譜法分析板藍(lán)根多糖所含單糖的方法，其準(zhǔn)確可靠，靈敏度較高，取樣量少，且分離效果理想，適用于板藍(lán)根多糖樣品的測(cè)定。由本法測(cè)定的板藍(lán)根多糖結(jié)果顯示，板藍(lán)根多糖中主要是D-葡萄糖、L-鼠李糖和D-半乳糖組成。該研究成果發(fā)表在時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥(2012，23(1)：236-237.)雜志。
　　 第六章，借助水蒸汽蒸餾法提取板藍(lán)根揮發(fā)性成分，GC-MS聯(lián)用和NIST2008版質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)板藍(lán)根揮發(fā)性

12、成分進(jìn)行分析，篩選出20個(gè)色譜峰，初步確定了其中的17個(gè)化合物。安徽產(chǎn)板藍(lán)根中含有十六酸甲酯(Hexadecanoicacid Methyl ester)、9，12，15-十八碳三烯酸甲酯((Z，Z，Z)-9，12，15-Octadecatrienoicacid Methyl ester)的比例最大。首次在板藍(lán)根揮發(fā)性成分中發(fā)現(xiàn)：鄰苯二甲酸二乙酯(Diethyl Phthalate)、鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate

13、)、二十烷醇(1-Eicosanol)、十七烷醇(n-Heptadecanol-1)和9-十六碳烯酸甲酯((Z)-9-Hexadecenoic acid Methyl ester)。結(jié)果說(shuō)明不同產(chǎn)地因素對(duì)板藍(lán)根揮發(fā)性成分的含量和化合物種類都有明顯的影響。
　　 第七章，采用最新的傅里葉變換紅外一衰減全反射技術(shù)(ATR-FTIR)對(duì)板藍(lán)根藥材展開(kāi)了整體質(zhì)量分析。通過(guò)坐標(biāo)轉(zhuǎn)換、背景扣除、平滑、基線校正和歸一化處理后，首次建立了11個(gè)

14、產(chǎn)地板藍(lán)根藥材的波數(shù)(ν，cm-1)--吸光率(A)中紅外光譜圖。依據(jù)相似度的夾角余弦法計(jì)算公式，得到了11個(gè)產(chǎn)地板藍(lán)根藥材之間中紅外光譜相似度值。對(duì)比板藍(lán)根主要化合物、板藍(lán)根提取部位和板藍(lán)根藥材之間譜圖，認(rèn)為板藍(lán)根藥材主要含有水溶性成分，這其中包括有板藍(lán)根多糖。板藍(lán)根的良好臨床療效主要來(lái)源于板藍(lán)根水溶性成分。
　　 總之，本論文針對(duì)板藍(lán)根及其有效成分的樣品前處理和樣品分析技術(shù)這兩大熱點(diǎn)難點(diǎn)問(wèn)題，發(fā)展了相關(guān)高提取率、快速便捷的新