重組人表皮生長(zhǎng)因子預(yù)防苯扎氯銨結(jié)膜上皮損害的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、苯扎氯銨為滴眼液中最常用的防腐劑，發(fā)揮抗菌防腐的作用。越來(lái)越多的動(dòng)物試驗(yàn)及臨床觀察表明，苯扎氯銨對(duì)于眼表上皮具有損害作用。粘蛋白是眼表淚膜的重要組成成分，對(duì)維持眼表正常生理功能起著極其重要的作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，重組人表皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)大鼠氣管上皮細(xì)胞粘蛋白的合成和分泌。本文進(jìn)行了重組人表皮生長(zhǎng)因子預(yù)防苯扎氯銨結(jié)膜上皮損害的實(shí)驗(yàn)研究。 第一章苯扎氯銨對(duì)人結(jié)膜上皮細(xì)胞毒性及粘蛋白表達(dá)影響的體外研究 目的：探討苯扎氯銨對(duì)體外培養(yǎng)

2、人結(jié)膜上皮細(xì)胞毒性及粘蛋白MUC1表達(dá)的影響。 方法：采用培養(yǎng)的3-5代人結(jié)膜上皮細(xì)胞，將不同濃度的BAC(0.01％，0.005％，0.001％，0.0005％，0.0001％)單次作用于結(jié)膜上皮細(xì)胞15分鐘，分別于處理細(xì)胞后6，12，24，48，72小時(shí)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，于處理細(xì)胞后48小時(shí)固定，掃描電鏡觀察拍照。于處理細(xì)胞后0，6，12，24，48，72小時(shí)提取RNA及蛋白，采用RT-PCR及Westernblot方法

3、檢測(cè)MUC1表達(dá)水平。 結(jié)果：自BAC處理后6小時(shí)起，與對(duì)照組相比，各濃度BAC均使細(xì)胞活力下降(P<0.05)。經(jīng)過(guò)72小時(shí)的恢復(fù)期，細(xì)胞活力未見(jiàn)恢復(fù)。隨BAC濃度增高，細(xì)胞表面微絨毛消失，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度收縮至脫落至大部分溶解壞死。0.01％，0.005％BAC作用后12至72小時(shí)可觀察到結(jié)膜上皮細(xì)胞MUC1基因表達(dá)下調(diào)，0.001％，0.0005％BAC作用后，24至48小時(shí)出現(xiàn)MUC1基因表達(dá)的下調(diào)，72小時(shí)恢復(fù)。0.0

4、1％BAC作用后6至72小時(shí)檢測(cè)到MUC1蛋白表達(dá)下降，而0.005％BAC作用后12至72小時(shí)MUC1蛋白表達(dá)下降，0.001％，0.0005％BAC作用后72小時(shí)MUC1蛋白表達(dá)減少。 結(jié)論：BAC對(duì)于培養(yǎng)的人結(jié)膜上皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，并下調(diào)MUC1的表達(dá)，其細(xì)胞毒性具有劑量依賴(lài)性及不可逆性，對(duì)MUC1的下調(diào)作用具有時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性。 第二章重組人表皮生長(zhǎng)因子對(duì)人結(jié)膜上皮細(xì)胞BAC損害保護(hù)作用的體外研究

5、 目的：探討重組人表皮生長(zhǎng)因子對(duì)人結(jié)膜上皮細(xì)胞BAC損害的保護(hù)作用. 方法：采用培養(yǎng)的3-5代人結(jié)膜上皮細(xì)胞，將BAC溶解于培養(yǎng)基中，終濃度為0.0005％。將rhEGF溶解于含0.0005％BAC中，終濃度分別為100ng/ml，200ng/ml，500ng/ml，1ug/ml。單次作用于結(jié)膜上皮細(xì)胞15分鐘，于處理細(xì)胞后48小時(shí)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。提取RNA，采用RT-PCR方法檢測(cè)MUC1表達(dá)水平。于72小時(shí)提取細(xì)胞蛋白

6、，Westernblot方法檢測(cè)MUC1表達(dá)水平。 結(jié)果：加藥處理后48小時(shí)，與對(duì)照組相比，0.0005％BAC，500ng/ml，1ug/mlrhEGF組MUC1mRNA表達(dá)水平下降。100ng/ml，200ng/mlrhEGF組MUC1mRNA表達(dá)水平無(wú)變化。與0.0005％BAC組相比，100ng/ml，200ng/mlrhEGF組MUC1mERNA表達(dá)水平顯著提高。加藥處理后72小時(shí)，與對(duì)照組相比，o.0005％BAC，

7、500ng/ml，1ug/mlrhEGF組MUC1蛋白表達(dá)水平下降。100ng/ml，200ng/mlrhEGF組MUC1蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯改變。與0.0005％BAC組相比，100ng/ml，200ng/mlrhEGF組MUC1蛋白表達(dá)水平顯著提高。加藥處理后72小時(shí)，與對(duì)照組相比，0.0005％BAC及各濃度rhEGF均使細(xì)胞活力下降(P<0.05)。與0.0005％BAC相比，各濃度組rhEGF對(duì)細(xì)胞活力無(wú)提高。 結(jié)論：r

8、hEGF對(duì)結(jié)膜上皮粘蛋白MUC1的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)作用可預(yù)防BAC誘導(dǎo)的結(jié)膜上皮細(xì)胞MUC1表達(dá)下降。 第三章重組人表皮生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠結(jié)膜上皮BAC損害保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn) 研究一、大鼠結(jié)膜上皮BAC損害模型的建立 目的：建立大鼠結(jié)膜組織BAC損害模型。 方法：健康SD(Spraguedawley)大鼠30只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組，溶劑BSS組，0.5％BAC組，0.1％BAC組，0.05％BAC組，

9、0.01％BAC組。每組5只。每天四次點(diǎn)眼。于用藥后第七天處死大鼠后眼球取材，行結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查，提取結(jié)膜組織RNA及蛋白，檢測(cè)MUC1mRNA及蛋白表達(dá)水平。OCT固定結(jié)膜組織，冰凍切片，免疫熒光染色檢查MUC1及MUC5AC表達(dá)水平。 結(jié)果：與對(duì)照組及BSS組相比，各濃度BAC組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，0.5％BAC組結(jié)膜杯狀細(xì)胞幾乎消失，MUC5AC蛋白表達(dá)減少。用藥一周后，0.5％BAC組大鼠結(jié)膜組織M

10、UC1mRNA表達(dá)水平下降，其余各濃度組及BSS組大鼠結(jié)膜組織MUC1mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化。免疫熒光結(jié)果顯示，0.5％BAC組大鼠結(jié)膜組織MUC1蛋白表達(dá)水平下降，其余各濃度組及BSS組大鼠結(jié)膜組織MUC1蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。 結(jié)論：BAC可引起大鼠結(jié)膜組織損害，結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，滴用0.5％BAC-周后大鼠結(jié)膜組織MUC1表達(dá)下降。 二、重組人表皮生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠結(jié)膜組織BAC損害保護(hù)作用研究 目的

11、：探討重組人表皮生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠結(jié)膜組織BAG損害的保護(hù)作用. 方法：健康SD(Spraguedawley)大鼠30只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組，溶劑BSS組，0.5％BAC組，0.5％BAC+10ug/mlrhEGF組，0.5％BAC+20ug/mlrhEGF組，0.5％BAC+50ug/mlrhEGF組。每組5只。每天四次點(diǎn)眼。于用藥后第七天處死大鼠后眼球取材，行結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查，提取結(jié)膜組織RNA及蛋白，檢測(cè)MUC1表達(dá)水平

12、，OCT固定結(jié)膜組織，冰凍切片，免疫熒光染色檢查MUC1及MUC5AC表達(dá)水平。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，0.5％BAC組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞幾乎消失(P<0.05)。與0.5％BAC組相比，0.5％BAC+10ug/mlrhEGF，0.5％BAC+20ug/mlrhEGF，0.5％BAC+50ug/mlrhEGF組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.05)，MUC5AC蛋白表達(dá)增強(qiáng)。與對(duì)照組相比，0.5％BAC組MUC1mRNA表達(dá)水平

13、下降，0.5％BAC+10ug/mlrhEGF，0.5％BAC+20ug/mlrhEGF，0.5％BAC+50ug/mlrhEGF組大鼠結(jié)膜組織MUC1mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化。免疫熒光結(jié)果顯示，0.5％BAC+10ug/mlrhEGF，0.5％BAC+20ug/mlrhEGF組大鼠結(jié)膜上皮MUC1蛋白增強(qiáng)，其中0.5％BAC+20ug/mlrhEGF與對(duì)照組最為接近。 結(jié)論：rhEGF可部分預(yù)防BAC引起的大鼠結(jié)膜組織損害，