腸道粘附菌群穩(wěn)態(tài)作為魚類健康評(píng)估指標(biāo)的探究.pdf

1、動(dòng)物腸道黏膜表面時(shí)時(shí)都暴露于復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的微生物群落之中，因此，腸黏膜層的主要功能之一是作為抵抗駐留在腸腔中的大量細(xì)菌的屏障。然而，研究者往往只關(guān)注到了黏膜層上皮細(xì)胞以及他們之間的緊密連接結(jié)構(gòu)，卻常常遺忘和忽視了一個(gè)重要的防御系統(tǒng)，那就是粘液層，這一層就是微生物-宿主互作、相互影響的最初接觸面。微生物與宿主腸道共同進(jìn)化形成相互有效的適應(yīng)機(jī)制，并且在不同腸道區(qū)域呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。研究宿主腸道、粘液蛋白以及微生物互作過程中的特點(diǎn)以及關(guān)系，對(duì)更

2、好的理解微生物與宿主互作提供了基礎(chǔ)，為水產(chǎn)動(dòng)物腸道健康研究以及發(fā)掘新的益生菌都具有重要意義。本論文首先通過蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及16S測序技術(shù)分別對(duì)模式動(dòng)物斑馬魚的腸道粘液、腸道本身、腸道粘液粘附菌群按照斑馬魚腸道自然折疊分段進(jìn)行了全面透徹的研究，發(fā)掘魚類腸道不同區(qū)域的功能、與腸道健康相關(guān)的蛋白、基因以及粘附菌群分布差異及特點(diǎn)，揭示腸道粘附微生物穩(wěn)態(tài)對(duì)于腸道以及宿主健康的重要性。最后嘗試以經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類代表羅非魚為例說明實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖中腸

3、道粘附菌群作為腸道健康評(píng)價(jià)指標(biāo)的實(shí)際應(yīng)用以及評(píng)價(jià)意義。主要結(jié)論如下:
　　1.通過對(duì)正常養(yǎng)殖斑馬魚腸道從前至后自然分為三段的順序進(jìn)行粘液染色，發(fā)現(xiàn)斑馬魚腸道粘液在不同區(qū)域的厚度不一致，但是都只有一層，按照中腸、前腸、后腸的順序逐漸降低。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定篩選差異蛋白，中腸與前腸比較有353個(gè)，后腸與前腸比較有329個(gè)，但是后腸與中腸的比較只有201個(gè)，說明前腸差異蛋白的數(shù)目最多;隨后進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，不同腸道區(qū)域的顯著差異

4、蛋白根據(jù)功能多涉及到營養(yǎng)代謝通路，表明主要差異蛋白與營養(yǎng)相關(guān)。最后經(jīng)過篩選獲得具有不同黏膜屏障功能的蛋白分布，發(fā)現(xiàn)在不同腸道區(qū)域分別與機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障以及微生物屏障相關(guān)的粘蛋白分布特點(diǎn)，揭示不同腸道區(qū)域粘液采用不同的屏障策略。
　　2.轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)比較正常養(yǎng)殖斑馬魚前中后腸差異表達(dá)基因，后腸相對(duì)于前腸以及中腸具有更大的差異，無論是顯著性上調(diào)還是下調(diào)的基因都在后腸數(shù)量上顯著高于前腸與中腸，說明在表達(dá)模式上后腸的差異性。通

5、路富集分析后，在前腸與中腸之間的顯著差異基因一共被注釋到8個(gè)具有顯著差異的通路，在后腸與前腸以及后腸與中腸之間的比較分別具有23個(gè)和24個(gè)顯著差異的通路，其中18個(gè)是共同的通路，這也更加說明了后腸的功能差異性。經(jīng)過篩選與腸道健康相關(guān)的基因，我們發(fā)現(xiàn)與腸道免疫進(jìn)程以及腸道上皮發(fā)育相關(guān)的基因多分布于后腸，前腸相對(duì)較少，最少的是中腸，說明腸道在不同區(qū)域的免疫調(diào)節(jié)功能以及細(xì)胞屏障功能的差異。但是具有調(diào)節(jié)粘液分泌以及腸上皮分化的基因gata5在中

6、腸最豐富，與腸道粘液的厚度存在很大的相關(guān)性，暗示這一基因在腸道中與粘液屏障的正向關(guān)系。
　　3.16S測序技術(shù)比較正常養(yǎng)殖斑馬魚前中后腸粘液粘附菌群特點(diǎn)。從整體結(jié)構(gòu)上來看，斑馬魚前中后腸的粘液粘附菌群存在明顯的差異，前腸與后腸具有更加相似的結(jié)構(gòu)。不同部位主要以變形菌門(Proteobacteria)為主，隨后是梭桿菌門(Fusobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)，相對(duì)比例存在顯著性不同。在屬水平上，除去“unkn

7、own”的部分，鯨桿菌屬（Cetobacterium）和鄰單胞菌屬（Plesiomonas）占有主要地位，其中鯨桿菌屬（Cetobacterium）在前中后腸的不同部位體現(xiàn)出顯著性的豐度差異，在中腸的相對(duì)豐度最大，達(dá)到31.35±1.21％，前腸以及后腸分別為8.67±0.50％和13.14±3.43％。鏈球菌屬（Streptococcus）和乳球菌屬（Lactococcus）在前腸豐度最高沿著腸道延伸往后逐漸下降，在中后腸無差異;假單

8、胞菌屬（Pseudomonas）和希瓦氏菌屬（Shewanella）在前中腸相對(duì)豐度無差異，在后腸顯著降低。結(jié)合中腸粘液最厚、中腸鯨桿菌屬（Cetobacterium）豐度最高的特點(diǎn)以及以往研究，我們認(rèn)為鯨桿菌屬具有更好的魚類定植能力，是魚類微生物屏障功能的重要組成部分。以此也說明在評(píng)價(jià)腸道以及宿主自身健康上粘附菌群不可被忽視以及與內(nèi)容物菌群混為一團(tuán)，而應(yīng)該被單獨(dú)提出來作為健康評(píng)估指標(biāo)。
　　4.將粘附菌群作為一個(gè)魚類健康指標(biāo)，結(jié)

9、合其他腸道健康相關(guān)檢測手段，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)在魚類飼料中植物性蛋白替代魚粉后添加植酸酶的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。1，000 U/kg飼料植酸酶的添加明顯改善了粘附菌群多樣性:變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和棲熱菌門（Thermus）的相對(duì)豐度得到提升;從屬水平來看，梭菌屬（Clostridium sp.）和棲熱菌屬（Thermus sp.）的相對(duì)豐度都受到微生物植酸酶的顯著升高調(diào)控。伴隨著的變化是促進(jìn)了磷

10、的利用率，升高腸道微絨毛密度的同時(shí)降低微絨毛長度;腸道應(yīng)激因子Hsp70以及炎癥因子Tnf-α和Tgf-β的水平都被顯著性升高，顯示出由于微生物植酸酶的添加誘導(dǎo)了更高的腸道應(yīng)激和炎癥狀態(tài)。因此本研究認(rèn)為粘附菌群優(yōu)化，一定程度能夠改善腸道以及宿主福利，但是飲食的直接作用可能會(huì)高于菌群優(yōu)化帶來的益處。從本研究可以看出粘附菌群的改變需要得到重視，在評(píng)估魚類健康上，可以從一個(gè)新的角度進(jìn)行說明，但是關(guān)于腸道健康與粘附菌群的關(guān)系需要更多的深入研究。