細(xì)胞因子融合蛋白質(zhì)粒及在體電脈沖技術(shù)增強(qiáng)治療性HBV DNA疫苗免疫效果的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染患者自身抗HBV特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)是決定HBV感染自然史和轉(zhuǎn)歸的重要因素之一，探尋有效的免疫調(diào)節(jié)治療手段來(lái)激活或增強(qiáng)慢性乙型肝炎(CHB)患者機(jī)體抗HBV特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，以達(dá)到打破免疫耐受或提高現(xiàn)有抗病毒藥療效的目的，是目前慢性HBV感染防治領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，將成為今后抗病毒治療策略調(diào)整的趨勢(shì)。 本項(xiàng)研究以BALB／c小鼠、新西蘭家兔、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物猴及HBV轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠為動(dòng)物模型和研究對(duì)象，評(píng)

2、價(jià)和探討pFP及EP分別增強(qiáng)和提高治療性HBVDNA疫苗免疫原性及質(zhì)粒宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染率的輔助效果和機(jī)理。 第一章：雙質(zhì)粒HBVDNA疫苗及在體電脈沖儀(EP)的研制和檢定 治療性雙質(zhì)粒HBVDNA疫苗系采用基因重組技術(shù)構(gòu)建的HBV包膜中蛋白(preS2+S)基因真核表達(dá)質(zhì)粒(HBVDNA疫苗)聯(lián)合佐劑質(zhì)粒組成的雙質(zhì)粒治療性DNA疫苗。在接種HBVDNA疫苗的同時(shí)，聯(lián)合注射編碼人白細(xì)胞介素融合蛋白(IL-2／IFN-γ)基

3、因質(zhì)粒作為佐劑，以輔助前者對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，使其激活的T細(xì)胞向Th1亞群分化，以期望更有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答而打破因慢性HBV感染所導(dǎo)致的機(jī)體免疫耐受，達(dá)到清除病毒的治療目的。 本研究中，將編碼HBV胞膜中蛋白的基因序列插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1構(gòu)建了重組pS2.S質(zhì)粒。為增強(qiáng)其免疫原性，我們構(gòu)建了IL-2／IFN-γ融合蛋白佐劑質(zhì)粒pFP，它是由IL-2信號(hào)肽序列，IL-2全基因序列，24bp連接序列(編碼AGS

4、GGGGS)以及IFN-γ的全基因序列順序連接在pCR的鈍端構(gòu)成。分子模擬根據(jù)pFP基因編碼的IL-2和IFN-γ融合蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行。pFP所表達(dá)的蛋白的空間構(gòu)象及與天然IL-2和IFN-γ構(gòu)象的比較通過(guò)數(shù)字分子模型軟件來(lái)(NewProvidence，PA)完成。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，以ELISA，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)-Westernblotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的基因表達(dá)，并分別以CTLL-2依賴細(xì)胞株

5、／MTT比色法和微量細(xì)胞病變抑制法(WISH-VSV)檢測(cè)pFP轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)上清中IL-2及IFN-γ活性。 第二章：pFP增強(qiáng)DNA疫苗免疫原性的實(shí)驗(yàn)研究 觀察佐劑質(zhì)粒(pFP)以不同劑量和給藥方式聯(lián)合DNA疫苗(pS2·S)應(yīng)用誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫(血清抗-HBs水平)的效果，摸索出最適的免疫接種方法(包括免疫劑量、雙質(zhì)粒配伍和給藥途徑)，以提高DNA疫苗的體內(nèi)免疫效果并為下一步確定細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物接種方式提供

6、參考。 2.1pFP聯(lián)合HBVDNA疫苗免疫誘導(dǎo)體液免疫結(jié)果 三個(gè)不同劑量的HBVDNA疫苗(pS2.S)單獨(dú)免疫BALB／c小鼠后血清抗-HBs水平及陽(yáng)性數(shù)觀察結(jié)果，大(100μug/只)、中劑量組(50μg／只)初次免疫2周時(shí)分別為86.0±46.6mIU／ml，45.8±26.0mIU／ml并可誘導(dǎo)組內(nèi)全部動(dòng)物抗體水平呈陽(yáng)性，而低劑量組(10μug／只)水平為16.2±9.3mIU／m，組內(nèi)抗體陽(yáng)性數(shù)僅為3只(每組

7、5只)。4、8、14周時(shí)各組抗體水平均有升高，但高、中劑量組升高較低劑量組更為明顯。 聯(lián)合免疫效果顯示，高、中劑量組2、4周時(shí)均能誘導(dǎo)組內(nèi)全部動(dòng)物抗體水平呈陽(yáng)性，二組4周時(shí)抗體水平較低劑量組升高明顯，差異具顯著性(P<0.05)。 2.2pFP聯(lián)合pS2.S誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答結(jié)果 pFP(50ug／只)聯(lián)合pS2·S(50μg／只)免疫組小鼠脾細(xì)胞體外經(jīng)HBsAg刺激培養(yǎng)上清IL-2／IFN-Y水平(263.5±5

8、2.0／38.4±11.9pg／ml)較同劑量的pS2·6聯(lián)合空載體pcDNA3.1免疫組(149.6±22.2／10.1±4.3pg／ml)高，差異具顯著性(P<0.01)；IL-4水平于各組質(zhì)粒免疫影響不明顯。 2.3不同細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合pS2.S免疫誘導(dǎo)HBsAg-特異性免疫應(yīng)答結(jié)果 結(jié)果顯示，pmlL-2+pmIFN-γ[(2.5+2.5)μg／只]聯(lián)合pS2.S免疫誘導(dǎo)HBsAg-特異性體液免疫和細(xì)胞免疫效

9、果最佳，并與相同劑量的pS2·S+pFP組效果相當(dāng)，主要表現(xiàn)為其組內(nèi)誘導(dǎo)的特異性分泌IFN-γT細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)動(dòng)物數(shù)目與單獨(dú)使用細(xì)胞因子質(zhì)粒(pmlL-2或pmIFN-γ)及pmFP免疫組(未獲得陽(yáng)性應(yīng)答)具本質(zhì)性差別，提示IL-2及IFN-γ質(zhì)粒作為免疫佐劑在增強(qiáng)HBVDNA疫苗免疫效果上具有協(xié)同效應(yīng)。而鼠源性融合蛋白(pmFP)在本實(shí)驗(yàn)中未顯示出佐劑效應(yīng)，推測(cè)可能與其構(gòu)建時(shí)所選用的連接肽基因(與人源性pFP相同)未能在融合蛋白分子結(jié)構(gòu)

10、上保持IL-2及IFN-γ各自活性有關(guān)。 第三章：在體電脈沖法提高HBVDNA疫苗免疫效果的實(shí)驗(yàn)研究 本研究以新西蘭家兔、恒河猴及食蟹猴為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察評(píng)價(jià)EP通過(guò)提高裸DNA質(zhì)粒在宿主體內(nèi)細(xì)胞導(dǎo)入率，增強(qiáng)HBVDNA疫苗誘導(dǎo)大體重動(dòng)物特異性免疫應(yīng)答效果。另采用高水力學(xué)注射法(hydrodynamicinjection或水力注射法)將質(zhì)粒pS2.S轉(zhuǎn)染至BALB／c小鼠肝細(xì)胞內(nèi)作為模型，觀察EP介導(dǎo)的pS2.S免疫對(duì)該模

11、型小鼠肝細(xì)胞HBsAg表達(dá)的抑制效果。 3.1EP聯(lián)合接種HBVDNA疫苗誘導(dǎo)兔和猴特異性免疫應(yīng)答結(jié)果 整個(gè)實(shí)驗(yàn)整個(gè)觀察過(guò)程，未經(jīng)EP介導(dǎo)的高劑量[(1000+1000)μg/只]雙質(zhì)粒HBVDNA疫苗(pS2.S+pFP)免疫組內(nèi)各只動(dòng)物(家兔或猴)血清抗-HBs均為陰性水平(<10mIU／ml)。 3.2EP介導(dǎo)的HBVDNA疫苗免疫對(duì)小鼠肝內(nèi)HBsAg表達(dá)水平的影響 觀察肝組織病理及血清轉(zhuǎn)氨酶(AL

12、T)水平變化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物經(jīng)水力注射轉(zhuǎn)染pS2.S后肝組織病理無(wú)明顯改變，盡管血清ALT呈現(xiàn)短暫性升高，但各時(shí)間點(diǎn)上pS2.S+EP與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。 第四章：pFP聯(lián)合EP提高治療性HBVDNA疫苗效果的評(píng)價(jià) 本研究以健康BALB／c小鼠及HBV轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠為研究對(duì)象，分別比較分析和系統(tǒng)研究pFP、EP單獨(dú)和二者聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)HBVDNA疫苗體液免疫及細(xì)胞免疫效果的輔助作用，探尋最佳的接種組合方式及給藥劑量

13、。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步評(píng)價(jià)和探討聯(lián)合免疫增強(qiáng)HBVTg小鼠細(xì)胞免疫及促進(jìn)病毒應(yīng)答的治療效果及初步作用機(jī)理。 4.1健康BALB／c小鼠免疫應(yīng)答效果 研究結(jié)果表明，EP以提高HBVDNA疫苗體液免疫應(yīng)答效果最為明顯，其輔助作用較pFP強(qiáng)；而在本研究中僅pFP能顯示出明顯增強(qiáng)DNA疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效果的佐劑作用。因此，我們認(rèn)為EP聯(lián)合pFP在HBVDNA疫苗免疫(即A組：pS2.S+pFP+EP)能獲得最佳的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)

14、答效果。以上述組合方式接種不同劑量的HBVDNA疫苗，結(jié)果顯示具有一定的劑量依賴性，為進(jìn)一步的HBVTg動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)有效劑量的選擇奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 4.2HBVTg小鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本研究結(jié)果表明，pFP能夠顯著增強(qiáng)EP介導(dǎo)的HBVDNA疫苗免疫HBVTg的治療效果，表現(xiàn)為pFP聯(lián)合免疫能持續(xù)性抑制HBVDNA的復(fù)制及表達(dá)。EP的引用大大降低了質(zhì)粒的有效接種劑量。觀察終點(diǎn)(12周)時(shí)，pFP聯(lián)合HBVDNA疫苗免疫組Tg

15、小鼠血清HBVDNA水平顯著低于DNA疫苗單獨(dú)免疫及對(duì)照組，個(gè)體血清HBVDNA及肝組織HBsAg表達(dá)水平降低的同時(shí)，伴隨其血清ALT水平及HBsAg特異性IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)目的升高。值得注意的是，DNA疫苗免疫組肝臟細(xì)胞空泡樣變較對(duì)照組明顯，可能與DNA疫苗免疫所介導(dǎo)的HBV特異性或非特異性免疫應(yīng)答造成的肝臟炎癥損傷有關(guān)。由于小鼠動(dòng)物模型基礎(chǔ)上研究外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)免疫應(yīng)答水平的局限，本文結(jié)果中病原學(xué)與免疫學(xué)應(yīng)答相關(guān)性的研

16、究?jī)H限于觀察結(jié)束的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，但所要提示的與近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論基本一致，即HBV的清除與溶細(xì)胞或非溶細(xì)胞性免疫應(yīng)答有關(guān)。 綜上所述，Th1型細(xì)胞因子IL-2／IFN-γ融合蛋白編碼基因質(zhì)粒(pFP)聯(lián)合HBVDNA疫苗(pS2.S)接種能有效增強(qiáng)pS2.S的免疫效果，pFP與pS2.S劑量按1:1配伍混合共注射免疫效果最佳；在體電脈沖(EP)技術(shù)通過(guò)提高質(zhì)粒DNA體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，有效增強(qiáng)HBVDNA疫苗在各種動(dòng)物(包括非人類靈