柚皮素及聚乙二醇增強(qiáng)乙肝DNA疫苗免疫效果的研究.pdf

1、背景:
　　 乙肝是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病之一。我國HBsAg攜帶者超過1.2億，其中慢性乙型肝炎攜帶者約三千萬，每年約有100-150萬人死于急慢性HBV感染。對(duì)這類患者目前尚缺乏有效的治療方法，常導(dǎo)致患者病情遷延不愈，部分患者發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，給社會(huì)和家庭帶來極為沉重的負(fù)擔(dān)。目前對(duì)于慢性乙型肝炎患者，主要還是通過抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、改善肝功能和和抗肝纖

2、維化等手段進(jìn)行綜合治療，效果并不理想。因此接種乙肝疫苗是預(yù)防和控制乙肝病毒傳播的重要措施。然而目前的乙肝疫苗還存在著以下幾個(gè)問題：第一，現(xiàn)有疫苗不能打破乙肝患者或乙肝病毒攜帶者機(jī)體的免疫耐受并清除病毒；第二，對(duì)可能逃避現(xiàn)有疫苗保護(hù)作用的HBsAg變異株的存在還有爭議；第三，在進(jìn)行乙肝全程免疫的人群中，約有5％～10％的人不產(chǎn)生保護(hù)性抗體或抗體水平很低。
　　 近年來發(fā)展的乙肝DNA疫苗則有望解決這些問題。DNA疫苗同時(shí)具有類似減

3、毒活疫苗的優(yōu)點(diǎn)和滅活疫苗或亞單位疫苗的安全性，具有預(yù)防和治療疾病的雙重作用，近些年得到了快速而廣泛的發(fā)展。然而就目前而言，其總的免疫效果仍不盡人意。比如，DNA疫苗在小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中免疫效果較好，在大動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中卻效果欠佳；再者，盡管DNA疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能起到很好的免疫保護(hù)作用，但在臨床試驗(yàn)中卻不能保護(hù)受試者抵抗病原體的攻擊。因此增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果是目前亟待解決的一個(gè)科學(xué)難題，而開發(fā)新型佐劑和緩釋劑使之能夠激發(fā)更強(qiáng)的細(xì)胞免疫是兩種有

4、效的手段。柚皮素具有抗菌、消炎、抗癌、解痙和利膽等作用。最近有研究報(bào)道柚皮素對(duì)急性免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。目前對(duì)于柚皮素是否增強(qiáng)乙肝核酸疫苗免疫效果的研究報(bào)道很少。因此本論文首先就柚皮素能否作為乙肝核酸疫苗的一種新型佐劑開展了深入的研究，探討了其增強(qiáng)乙肝核酸疫苗的免疫機(jī)制。
　　 另外，研究證實(shí)肽或蛋白質(zhì)的聚乙二醇化，能夠延緩其半衰期，增加其水溶性和穩(wěn)定性。目前對(duì)于聚乙二醇能否對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行包裹并具有延緩作用仍然沒有深入的研

5、究。因此本論文的第二部分工作選擇聚乙二醇作為發(fā)送系統(tǒng)對(duì)HBVDNA疫苗免疫效果開展系統(tǒng)的研究。
　　 目的:
　　 本研究利用柚皮素作為佐劑，通過檢測(cè)抗體水平，T細(xì)胞增殖的效果及體內(nèi)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)來評(píng)價(jià)其對(duì)乙肝DNA疫苗的影響，并通過細(xì)胞因子的檢測(cè)，進(jìn)一步闡明柚皮素增強(qiáng)乙肝DNA疫苗免疫效果的作用機(jī)理。同時(shí)研究聚乙二醇作為載體發(fā)送系統(tǒng)是否能夠增強(qiáng)HBV DNA疫苗的細(xì)胞免疫和體液免疫效果。
　　 方法:

6、r>　　 利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建含有HBV pre-S2和S基因的真核表達(dá)載體pVAX-S2，經(jīng)測(cè)序確定載體構(gòu)建成功后，用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)293T細(xì)胞確定轉(zhuǎn)染成功并表達(dá)S2基因后，我們將HBV DNA疫苗(pVAX-S2)單獨(dú)或不同濃度的柚皮素聯(lián)合HBV DNA疫苗(pVAX-S2)，PEG/pVAX-S2免疫C57BL/6小鼠，在最后一次免疫14天時(shí)檢測(cè)抗-HBs IgG、T淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子表達(dá)及體

7、內(nèi)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷作用(CTL)等免疫學(xué)指標(biāo)。
　　 結(jié)果:
　　 成功構(gòu)建含有HBV pre-S2和S基因的真核表達(dá)載體pVAX-S2。與僅免疫pVAX-S2比，不同濃度的柚皮素聯(lián)合HBV DNA疫苗(pVAX-S2)，PEG/pVAX-S2能夠增加免疫小鼠抗-HBs IgG水平；混合免疫組的T淋巴細(xì)胞體外經(jīng)乙肝表面抗原(HBsAg)刺激后，T淋巴細(xì)胞增殖數(shù)量顯著高于對(duì)照組；另外，混合免疫組CD4+T淋巴細(xì)胞中IL

8、-4和IFN-γ以及CD8+T淋巴細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。更重要的是，混和免疫組HBsAg特異性CTL顯著高于對(duì)照組。
　　 結(jié)論:
　　 研究結(jié)果顯示，柚皮素不但增強(qiáng)乙肝DNA疫苗的體液免疫反應(yīng)，而且增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。尤為重要的是，從治療角度上來講，1％柚皮素與DNA疫苗共同免疫組激發(fā)機(jī)體在CD4+或CD8+T細(xì)胞中IFN-γ的產(chǎn)生，這將有利于慢性感染者體內(nèi)病毒的清除和控制。研究中還發(fā)現(xiàn)，柚皮素增強(qiáng)了促炎

9、癥性因子IL-12的表達(dá)，下調(diào)了T淋巴細(xì)胞中抗炎癥因子IL-35和TGF-β的表達(dá)，啟動(dòng)了TGF-β的下游信號(hào)分子Smad家族。因此，柚皮素可以給機(jī)體提供一個(gè)抑制性因素少的微環(huán)境，從而更有利于誘發(fā)外源抗原產(chǎn)生更強(qiáng)大的免疫反應(yīng)。此外，柚皮素很容易與DNA疫苗混合并免疫動(dòng)物，而且柚皮素作為中藥制劑對(duì)動(dòng)物幾乎沒有任何明顯的不良反應(yīng)?？傊@些研究證實(shí)柚皮素不但增強(qiáng)了乙肝疫苗的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)了治療作用，而且也進(jìn)一步探索了其作用機(jī)制，這將