I型干擾素通路IRF8,IFIH1及TYK2基因多態(tài)性在河南漢族人群與SLE的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、背景與目的：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)是一種常見的、由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的自身免疫性疾病。其主要特征是機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致抗核抗體和其他自身抗體的產(chǎn)生，過(guò)多的免疫復(fù)合物形成和沉積，從而導(dǎo)致免疫紊亂。目前SLE的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，一般認(rèn)為是多因素致病，主要與環(huán)境因素和遺傳因素之間的相互作用引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在SLE患者的一級(jí)親屬中，患SLE的風(fēng)險(xiǎn)是一般正常

2、人群的20倍左右;同卵雙胞胎發(fā)病的一致率高達(dá)24％，而異卵雙胞胎是2％。說(shuō)明遺傳因素在SLE發(fā)病中起著重要的地位。
　　近年來(lái)研究證實(shí)干擾素家族及其免疫調(diào)控通路在SLE發(fā)病中扮演重要角色，尤其是Ⅰ型干擾素通路在SLE發(fā)病機(jī)制中起了關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)在SLE患者血清中IFN-α的水平明顯升高，近年來(lái)大規(guī)模的基因芯片技術(shù)也證實(shí)在SLE患者外周血單核細(xì)胞中干擾素(IFN)誘導(dǎo)基因呈顯著性高表達(dá)，并與疾病活動(dòng)及疾病嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。SL

3、E是一種復(fù)雜的多基因疾病，其易感基因較多。近年來(lái)，各國(guó)科學(xué)家對(duì)人類疾病易感基因多態(tài)性的研究越來(lái)越重視。單核甘酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)是人類基因組中最常見的一種基因多態(tài)性，是人群中存在個(gè)體差異的最主要的遺傳因素，也是造成人們患某種疾病存在不同風(fēng)險(xiǎn)和對(duì)藥物不同反應(yīng)的主要原因。因此說(shuō)發(fā)現(xiàn)和研究SNPs的工作在目前SLE的研究中倍受關(guān)注。迄今為止，已經(jīng)有5個(gè)大型的GWAS掃描確定了38個(gè)S

4、LE易感基因SNPs。關(guān)聯(lián)性分析已經(jīng)證實(shí)Ⅰ型干擾素通路中干擾素調(diào)節(jié)因子5(interferonregulatoryfactor5，IRF5)、酪氨酸激酶2(tyrosinekinase2，TYK2)作為SLE的風(fēng)險(xiǎn)基因。近期又有報(bào)道在歐洲人群中干擾素調(diào)節(jié)因子8(interferonregulatoryfactor8，IRF8)、干擾素誘導(dǎo)解旋酶1(IFN-inducedhelicaseCdomain-containingprotein1

5、，IFIH1)的SNPs與SLE存在關(guān)聯(lián)。SLE具有明顯的遺傳異質(zhì)性，這些基因在不同遺傳背景的種群中可能存在差異，因此有必要在其他人種中進(jìn)行驗(yàn)證。這些基因在不同種群中可能存在差異。目前在中國(guó)大陸漢族人群中，還沒有IRF8、IFIH1、TYK2基因SNPs與SLE的關(guān)聯(lián)性報(bào)道。IRF8、IFIH1及TYK2等參與Ⅰ型干擾素通路的調(diào)節(jié)，是Ⅰ型干擾素通路的關(guān)鍵組成部分，在Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，尤其是IFN-α的產(chǎn)生，以及作用機(jī)制方面發(fā)揮重要作用。

6、對(duì)這三個(gè)基因與SLE的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究，將有助于進(jìn)一步理解Ⅰ型干擾素通路在SLE發(fā)病中的作用。
　　我們采用改進(jìn)的多重高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)(iMLDR)基因分型技術(shù)，通過(guò)病例對(duì)照研究方法，探討干擾素通路IRF8、IFIH1及TYK2基因多態(tài)性在中國(guó)河南漢族人群中的分布特點(diǎn)以及與SLE的關(guān)聯(lián)性，以期對(duì)SLE的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)和參考。研究主要分三個(gè)部分進(jìn)行。
　　第一部分:IRF8基因多態(tài)性與SLE的關(guān)聯(lián)性研究
　　材料與

7、方法：
　　總共入選SLE患者358例，來(lái)自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，所有患者均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(AmericanCollegeofRheumatology，ACR)制定的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)招募357例健康對(duì)照者，與SLE患者無(wú)血緣關(guān)系，無(wú)風(fēng)濕免疫性疾病家族史。病例組女性303人（占84.6％），男性55人（占15.4％），平均年齡31.2±11.2;健康對(duì)照組，女性290人（占81.2％），男

8、性67人（占18.8％），平均年齡29.9±9.2。所有納入的觀察對(duì)象均是來(lái)自中國(guó)河南地區(qū)的漢族人群。SLE的12個(gè)有代表性的臨床表現(xiàn)包括:蝶形紅斑、光過(guò)敏、口腔潰瘍、漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、血管炎、腎損傷、血液系統(tǒng)損傷、神經(jīng)精神系統(tǒng)損傷、低補(bǔ)體血癥、抗dsDNA(+)及抗Sm(+)等，均符合ACR定義要求，另外，抗ds-DNA的檢測(cè)采用ELISA法，抗Sm檢測(cè)用免疫擴(kuò)散法。本研究方案經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象均簽署

9、了知情同意書。
　　采集研究對(duì)象外周靜脈血2ml，放置于5ml的EDTANa2抗凝管中，并提取DNA，-80℃冰箱中保存。利用HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行了標(biāo)簽SNP(tagSNP)位點(diǎn)的選擇，標(biāo)準(zhǔn)為位點(diǎn)在中國(guó)漢族人群中MAF(minorallelefrequency)＞0.1，r2＞0.8。本實(shí)驗(yàn)采用iMLDRTM多重SNP分型試劑盒對(duì)IRF8基因的18個(gè)tagSNPs(rs2270502,rs182511,rs2292982,r

10、s2292980,rs768410,rs16939967,rs11117415,rs12926854,rs9926411,rs8064189,rs2280378,rs8057456,rs9927932,rs10514611，rs1568391，rs1044873，rs11644034，rs2280381)進(jìn)行分型，原始數(shù)據(jù)文件用GeneMapper片段分析軟件。.
　　采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;效應(yīng)值選擇比值比(o

11、ddsratio，OR)及其95％可信區(qū)間(confidenceinterval，CI);應(yīng)用SHEsis軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)和Haploview軟件分析不同基因的單倍型、連鎖不平衡性以及是否符合Hardy-Weinberg平衡;應(yīng)用X2檢驗(yàn)對(duì)基因型及等位基因頻率在病例組與對(duì)照組間的分布進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;應(yīng)用單因素以及多因素Logistic

12、回歸對(duì)相關(guān)危險(xiǎn)因素與SLE的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度進(jìn)行分析;為減少多重比較中可能出現(xiàn)的Ⅰ型錯(cuò)誤率，進(jìn)行Bonferronicorrection，Pcorr＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.IRF8基因SNPs位點(diǎn)的各基因型頻率在兩組人群中均符合Hardy-Weinberg平衡定律。
　　2.在河南漢族人群中，多因素分析結(jié)果顯示，在調(diào)整年齡、性別后，IRF8基因的SNPs位點(diǎn)rs2280381的CC基因型和C等位基因與

13、SLE存在明顯關(guān)聯(lián)（分別是OR=0.140,95％CI:0.031-0.634,P=0.011;OR=0.611,95％CI:0.444-0.840,P=0.002)。rs2292980的CT基因型(OR=1.473，95％CI:1.037-2.091，P=0.030)，rs768410的GT基因型(OR=1.509，95％CI:1.056-2.157，P=0.024)及rs12926854的GA基因型(OR=1.421，95％CI:1

14、.043-1.937，P=0.026)及可能是SLE的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。
　　3.性別分層分析發(fā)現(xiàn)，IRF8rS2292980CT基因型(OR=1.537，95％CI:1.042-2.267,P=0.030)、rs768410GT基因型(OR=1.522,95％CI:1.028-2.255,P=0.036)、rS12926854GA基因型(OR=1.579，95％CI:1.118-2.231，P=0.009)及rs1044873CT基

15、因型(OR=1.470，95％CI:1.014-2.130，P=0.041)在河南漢族女性人群中可能是SLE的風(fēng)險(xiǎn)基因型;而IRF8rs16939967TT基因型(OR=0.345，95％CI:0.133-0.896，P=0.023)和IRF8rs2280381CC基因型(OR=0.160，95％CI:0.035-0.732，P=0.007)在河南漢族女性人群中對(duì)患SLE可能具有保護(hù)性效應(yīng)。
　　4.在IRF8基因SNPs與SLE

16、臨床表現(xiàn)的關(guān)聯(lián)性分析中發(fā)現(xiàn)，在河南漢族人群中，IRF8rs9926411G等位基因與SLE的關(guān)節(jié)炎存在關(guān)聯(lián)性，并且可能具有保護(hù)性作用(OR=0.610，95％CI:0.443-0.840，Pcorr=0.024);IRF8rs2280381C等位基因與SLE的低補(bǔ)體血癥存在關(guān)聯(lián)性，并且對(duì)低補(bǔ)體血癥的出現(xiàn)可能具有保護(hù)性作用(OR=0.462，95％CI:0.271-0.788，Pcorr=0.048)。
　　5.IRF8基因SNPs

17、位點(diǎn)之間均具有強(qiáng)烈的連鎖不平衡(D'＞0.96)。
　　6.單倍型分析中，SLE組CCGCGGAAAGACCCGCGT、CCTTGGAAAGGTCCTCGT兩種單倍型能顯著增加SLE的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=12.129,95％CI:4.204-34.992,P=3.90×10-6;OR=10.108,95％CI:2.297-44.470，P=0.002)，而另一種CGTTTGAAAGGTCCTCGT單倍型對(duì)SLE的發(fā)病有保護(hù)作用(OR=

18、0.350，95％CI:0.156-0.787，P=0.011)。
　　第二部分:IFIH1基因多態(tài)性與SLE的關(guān)聯(lián)性研究
　　材料與方法：
　　材料與方法同第一部分。位點(diǎn)篩選方面IFIH1基因共篩選了5個(gè)tagSNPs:rs1990760、rs3747518、rs3747517、rs16846565及rs72632。
　　結(jié)果：
　　1.IFIH1基因SNPs位點(diǎn)的各基因型頻率在兩組人群中均符合Hardy

19、-Weinberg平衡定律。
　　2.多因素分析結(jié)果顯示，IFIH1基因位點(diǎn)rs1990760、rs3747518、rs3747517、rs16846565及rs72632在河南漢族人群中與SLE無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性，推測(cè)IFIH1基因位點(diǎn)rs1990760、rs3747518、rs3747517、rs16846565及rs72632可能不是河南漢族人群SLE的相關(guān)遺傳因子。
　　3.性別分層分析發(fā)現(xiàn)，IFIH1rs1990760T

20、T基因型(OR=2.614，95％CI:1.074-6.366,P=0.029)、rs3747517TC基因型(OR=1.422,95％CI:1.007-2.008,P=0.045)以及rs3747517MinoralleleC等位基因(OR=1.313，95％CI:1.023-1.686，P=0.033)在河南漢族女性人群中可能是SLE的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。
　　4.IFIH1基因SNPs與臨床表現(xiàn)的關(guān)聯(lián)性分析顯示，IFIH1基因的5

21、個(gè)SNPsrs1990760、rs3747518、rs3747517、rs16846565、rs726323與SLE的主要臨床表現(xiàn)之間均無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性。
　　5.IFIH1基因SNPsrs1990760、rs3747518、rs3747517、rs16846565及rs72632之間具有強(qiáng)烈的連鎖不平衡(D'＞0.98)。
　　6.IFIH1基因SNPs主要構(gòu)建的CATAT、CACAT、TGTGT、CACAC及TATAT等5種

22、單倍型與SLE均無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性(P＞0.05）。
　　第三部分:TYK2基因多態(tài)性與SLE的關(guān)聯(lián)性研究
　　材料與方法：
　　材料與方法同第一部分。位點(diǎn)篩選方面TYK2基因共篩選了2個(gè)tagSNPs:rs2304256,rs280519。
　　結(jié)果：
　　1.TYK2基因SNPs位點(diǎn)的各基因型頻率在兩組人群中均符合Hardy-Weinberg平衡定律。
　　2.多因素分析結(jié)果顯示，TYK2基因位點(diǎn)rs2

23、304256和rs280519在河南漢族人群中與SLE無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性，性別分層分析也未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)，推測(cè)TYK2基因位點(diǎn)rs2304256和rS280519在河南漢族人群可能不是SLE的風(fēng)險(xiǎn)遺傳因子。
　　3.在TYK2基因SNPs與SLE臨床表現(xiàn)的關(guān)聯(lián)性分析中發(fā)現(xiàn)，在河南漢族人群中，TYK2rs280519A等位基因與SLE的蝶形紅斑存在關(guān)聯(lián)，對(duì)SLE的蝶形紅斑可能具有保護(hù)性作用(OR=0.641，95％CI:0.475-0.86

24、5，Pcorr=0.048)。
　　4.TYK2基因SNPs位點(diǎn)rs2304256和rs280519之間存在絕對(duì)的連鎖不平衡(D'=1.0)。
　　5.單倍型分析中，主要構(gòu)建的AA、CA及CG等3種單倍型頻率分布在患者組和對(duì)照組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.IRF8基因SNPsrs2292980、rs768410、rs12926854及rs2280381多態(tài)位點(diǎn)在中國(guó)河南漢族人群中與S

25、LE存在明顯關(guān)聯(lián)性。其中rs2292980、rs768410、rs12926854多態(tài)位點(diǎn)可能會(huì)導(dǎo)致SLE發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加;而rs2280381多態(tài)位點(diǎn)對(duì)SLE的發(fā)病可能具有保護(hù)性作用。
　　2.rs2292980、rs768410、rs12926854、rs2280381、rs1044873和口rs16939967多態(tài)位點(diǎn)在女性人群可能與SLE存在關(guān)聯(lián)性。
　　3.IFIH1、TYK2的SNPs在中國(guó)河南漢族人群與SLE無(wú)明顯

26、關(guān)聯(lián)性，但I(xiàn)FIH1rs1990760及rs3747517多態(tài)位點(diǎn)可能是女性人群SLE的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。
　　4.IRF8rs9926411多態(tài)位點(diǎn)與SLE的關(guān)節(jié)炎存在關(guān)聯(lián)性，IRF8rs2280381多態(tài)位點(diǎn)與SLE的低補(bǔ)體血癥存在關(guān)聯(lián)性，TYK2rs280519多態(tài)位點(diǎn)與SLE的蝶形紅斑存在關(guān)聯(lián)性，可能都具有保護(hù)性作用。
　　5.IRF8基因SNPs所構(gòu)建的單倍型CCGCGGAAAGACCCGCGT、CCTTGGAAAGG