靶向IL-1和RANKL的聯(lián)合基因治療磨損顆粒導致的無菌性假體松動的研究.pdf

1、第一部分應用IL-1受體阻斷劑和骨保護素聯(lián)合基因治療無菌性假體松動作用和機制的體外研究研究背景近年來隨著人們生活水平的提高,肥胖和老齡化帶來的一些疾病日益受到重視,比如晚期骨性關(guān)節(jié)炎,該病不僅給患者帶來痛苦,晚期關(guān)節(jié)畸形使患者喪失行動能力,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。伴隨人工關(guān)節(jié)技術(shù)的發(fā)展,關(guān)節(jié)置換手術(shù)對此難題迎刃而解,成為目前對嚴重關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病的常用治療方式。然而關(guān)節(jié)置換手術(shù)術(shù)后十年并發(fā)無菌性假體松動的發(fā)生率高達34%。無菌性假體松動發(fā)生

2、后需行關(guān)節(jié)翻修手術(shù),因關(guān)節(jié)翻修術(shù)創(chuàng)傷大難度高,不僅給患者帶來手術(shù)痛苦,也對實施手術(shù)的臨床醫(yī)師提出了更高的技術(shù)要求?；谀壳瓣P(guān)節(jié)置換手術(shù)的廣泛開展和無菌性假體松動是關(guān)節(jié)置換術(shù)后最常見的并發(fā)癥,越來越多的研究也在聚焦對無菌性假體松動的干預和治療。因關(guān)節(jié)特殊的解剖構(gòu)造,通常全身用藥往往很難維持關(guān)節(jié)周圍較高的藥物濃度,通過關(guān)節(jié)腔注射往往又對無菌性操作有很高的要求,而且該操作為有創(chuàng)操作,給病人帶來較大的痛苦,且無菌性假體松動是一個慢性進行性發(fā)展的

3、疾病,治療周期較長,病人常難以耐受數(shù)年的治療。如何采取一種給藥方式,能長期高效的維持局部的藥物濃度,又不至于引起全身血藥濃度的升高,引起不良反應。基因治療提供了一個很好的方法,通過對關(guān)節(jié)周圍組織的基因轉(zhuǎn)染,使局部組織能持續(xù)高效表達治療基因,從而達到持久高效維持局部藥物濃度的目的。無菌性假體松動的病理過程復雜,具體發(fā)生機制尚未完全闡明,但大部分研究表明假體周圍機械磨損產(chǎn)生的生物顆粒在無菌性假體松動的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的作用。關(guān)節(jié)假體因機

4、械活動中產(chǎn)生磨損顆粒,磨損顆粒一方面本身作為異物刺激機體產(chǎn)生炎癥反應,另一方面磨損顆粒也會對其周圍的軟組織的產(chǎn)生機械性損傷,受傷的組織也會誘發(fā)局部的炎癥反應。因局部炎癥反應釋放IL-1、TNF等大量炎癥介質(zhì),導致巨噬細胞活化并一步釋放大量炎癥介質(zhì),一方面活化的巨噬細胞加強對磨損顆粒異物的吞噬,然而人工關(guān)節(jié)常為金屬材料、高分子材料和陶瓷材料,這些材質(zhì)的磨損顆粒在被巨噬細胞吞噬后往往不能被消化,殘留的磨損顆粒繼續(xù)誘發(fā)炎癥的惡化,另一方面炎癥

5、因子促使大量破骨細胞生成,造成假體周圍骨溶解的加重,進一步導致了假體松動的發(fā)生,隨著假體松動的加重,假體與骨組織的機械磨損進一步加重,產(chǎn)生更多的磨損顆粒,磨損顆粒誘發(fā)更嚴重的炎癥和骨溶解。綜上所述,整個病理過程呈現(xiàn)一個惡性循環(huán)?；诖宋覀兲岢黾僬f：炎癥和骨溶解在無菌性假體松動的發(fā)生發(fā)展中既是-個相互聯(lián)系又是一個相互區(qū)別的過程。根據(jù)這個假說我們提出聯(lián)合應用IL-1受體阻斷劑和骨保護素(OPG)基因治療無菌性假體松動并初步探討無菌性假體松動

6、的病理發(fā)生機制。目的通過體外實驗聯(lián)合應用IL-1受體阻斷劑和骨保護素(OPG)基因治療抑制RAW細胞活化：一是研究聯(lián)合應用抗炎和抗骨溶解對無菌性假體松動治療的可行性,二是觀察兩者是否具有協(xié)同效果,是否優(yōu)于相同劑量的單獨治療組,三是進一步探討無菌性假體松動病理發(fā)生機制材料與方法1.細胞培養(yǎng)活化及基因轉(zhuǎn)染采用RAW264.7細胞株,將RAW細胞(2×104/m1)與鈦顆粒懸浮液(1×106/m1)于37℃,5%C02培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)(其中鈦顆

7、粒大小為2.3±0.618μ m,與關(guān)節(jié)假體松動后磨損顆粒大小相當),共同培養(yǎng)72小時后被隨機分為5組：第一組為IL-1受體阻斷劑單基因治療組,在分組后立即轉(zhuǎn)染800μl濃度為1×107pfu的編碼IL-1受體阻斷劑基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒液；第二組為OPG單基因治療組,轉(zhuǎn)染濃度為107particles/ml編碼OPG的腺相關(guān)病毒液,其轉(zhuǎn)染時間為編碼IL-1受體阻斷劑的病毒轉(zhuǎn)染后第3天,第三組為聯(lián)合基因治療組,其轉(zhuǎn)染半劑量的編碼IL-1受體阻

8、斷劑基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒和編碼骨保護素(OPG)的腺相關(guān)病毒；第四組為LacZ轉(zhuǎn)染對照組,轉(zhuǎn)染10’particles/ml編碼LacZ的腺相關(guān)病毒液；第五組為空白對照組,無任何病毒轉(zhuǎn)染。為提高聯(lián)合基因的治療時間,使retrovirus-IL-1Ra和AAV-OPG的基因表達達峰時間重疊,我們分別通過實驗檢測了retrovirus-IL-1Ra和AAV-OPG的轉(zhuǎn)染效率,確定了在retrovirus-IL-1Ra轉(zhuǎn)染后3天再轉(zhuǎn)染AAV-OP

9、G,每2天更換一次培養(yǎng)液,將各組每周的上清液收集在一起,經(jīng)過總共4周的培養(yǎng)將細胞收獲。2.酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測炎癥介質(zhì)IL-1在完成上述基因轉(zhuǎn)染后,各實驗組每周收取的上清液通過ELISA試劑盒進行檢測炎癥因子IL-1的釋放量,利用紫外分光光度計在405nm波長處讀出吸光度,繪制標準曲線,并根據(jù)標準曲線計算各實驗組IL-1的濃度。3.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色染色檢測破骨細胞RAW細胞經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染和4周的培養(yǎng)收獲,應

10、用TRAP試劑盒對各治療組進行TRAP染色,將濃度為1×106/ML的200μ l各基因轉(zhuǎn)染組RAW細胞液被甩到組織片上,將片子浸在acetone中固定30秒,片子然后在在0.1M acetate buffer (pH5.2),包含0.5mM naphthol AS-BI phosphoric acid,2.2mM FastGarnet GBC,和lOmM sodium37℃孵育1h,經(jīng)去離子水沖洗后停止反應封片。4. Real Tim

11、e-PCR檢測IL-1、RANK、TRAF6、JNK1、c-Fos、CPK基因的表達將基因轉(zhuǎn)染后各實驗組RAW細胞的RNA用TRIZOL試劑進行提取,逆轉(zhuǎn)錄反應中cDNA獲取,從0.5mg的總RNA在40ml的反應混合液中進行反應,混合液包含1X PCR buffer,500mM的nucleotide triphosphates,0.5Uml-1o的ribonuclease inhibitor,2.5mM的random hexamers

12、,5.5mM的MgCl2,和1.25Uml-1的reverse transcriptase。反應混合液按DNA在25℃作用10min,48℃作用5min,接下來95℃作用5min的模式下循環(huán).應用ABI Prism7700機器對炎癥因子IL-lb和信號分子RANK, c-Fos, TRAF6, JNK1,和CPK進行基因表達的檢測5.統(tǒng)計學分析應用SPSS軟件對各組數(shù)據(jù)進行T檢驗或方差分析多重比較,P<；0.05表示有統(tǒng)計學差異。結(jié)

13、果1.聯(lián)合基因治療的抗炎效果RAW264.7細胞(2×104)在體外與鈦顆粒懸浮液(1×106)共同培養(yǎng),然后用DFG-IL-1Ra-neo和AAV-GFP-OPG分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染,其中聯(lián)合基因治療組相比于單基因治療組采用半劑量(0.4×104pfu)轉(zhuǎn)染。107particles M-1的AAV-LacZ作為基因治療對照組。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)表明IL-1Ra基因治療組和聯(lián)合基因治療組在第一周就表現(xiàn)抑制IL-1的釋放,并且3周

14、各治療組均持續(xù)抑制IL-1釋放,但后期OPG治療組抑制效果稍差。4周培養(yǎng)獲取的RAW細胞經(jīng)RT-PCR檢測明顯降低了IL-1B的基因表達,且聯(lián)合基因治療組效果最佳。2.聯(lián)合基因治療在破骨細胞分化中的作用4周培養(yǎng)后獲取的RAW細胞經(jīng)酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,OPG和聯(lián)合基因治療組中TRAP陽性細胞明顯減少,IL-1Ra治療組效果稍差。雖然RAW264.7細胞系中多核細胞相對少,但TRAP染色的特性提示了破骨細胞分化成熟。RT-PC

15、R也表明聯(lián)合基因治療組明顯較低了RANK基因表達,暗示聯(lián)合基因治療具有良好的協(xié)同效果。3.基因治療對破骨細胞分化中分子機制探討應用RT-PCR對破骨細胞分化中信號分子進行檢測,以LacZ為對照基準,在IL-Ra、OPG.聯(lián)合基因治療組中cFos分別降低了54%、67%、88%；TRAF6分別降低了25%、31%、44%；在聯(lián)合基因治療組和IL-1Ra組JNK1分別降低了20%、16%；OPG組變化不明顯。聯(lián)合基因治療組CPK降低超過50

16、%,相對單基因治療組顯示更好的效果。結(jié)論1. IL-1Ra和OPG聯(lián)合基因治療能有效抗炎,抑制炎癥因子IL-1的釋放。2. IL-1Ra和OPG聯(lián)合基因治療能明顯抑制了破骨細胞分化。3. IL-1Ra和OPG聯(lián)合基因治療相比于單基因治療組有更好的效果,提示兩者有協(xié)同作用。第二部分利用無菌性假體松動小鼠模型對IL-1受體阻斷劑和骨保護素聯(lián)合基因治療的研究研究背景無菌性假體松動作為關(guān)節(jié)置換術(shù)后最常見的遠期并發(fā)癥,有文獻報告高達34%關(guān)節(jié)置換

17、術(shù)后病人會發(fā)生無菌性假體松動。一旦發(fā)生假體松動,不僅給患者帶來肉體上的疼痛,而且病情隨著負重活動增加呈進行加重,最終會導致再次喪失行走能力。目前主要的治療手段就是行關(guān)節(jié)翻修手術(shù),因手術(shù)復雜、操作困難、費用高等局限,探求一種新的治療方案來延緩或阻止無菌性假體松動的發(fā)生成為研究熱點。在研究無菌性假體松動的過程中,選擇和建立一種合適的動物模型成為重要內(nèi)容。有文獻報告選擇狗、馬、羊等大型動物用于模型創(chuàng)建,該模型優(yōu)點在于：與人類關(guān)節(jié)尺寸類似,而且

18、適合長期研究,缺點是：研究費用高,不易飼養(yǎng),樣本含量受限。也有采用air pounch小鼠模型模擬關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境,操作方便,但僅適于短期研究,且屬于急性期損失病理變化。本研究項目前期通過對小鼠膝關(guān)節(jié)植入鈦釘,并定期注射鈦顆粒,成功創(chuàng)建了無菌性假體松動的小鼠模型,既解決了樣本含量的受限,也適于長期研究的應用。無菌性假體松動的病理機制復雜,組織學顯示假體周圍常有炎性偽膜形成,大量炎性細胞浸潤和假體周圍骨溶解發(fā)生。多數(shù)學者認為假體磨損產(chǎn)生的顆粒是

19、導致假體周圍骨溶解,是人工關(guān)節(jié)晚期松動的主要原因。由于機械磨損產(chǎn)生的顆粒作為異物刺激局部發(fā)生炎癥反應,活化巨噬細胞,釋放大量IL-1、TNF、IL-6等炎癥因子,炎癥囚子進一步刺激成骨細胞、骨髓基質(zhì)細胞等上調(diào)核激活因子KB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor NF-KB ligand, RANKL)的表達。近年研究發(fā)現(xiàn),OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在骨組織代謝平衡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)

20、作用。RANKL與破骨細胞前體細胞表明RANK結(jié)合后,就會啟動破骨細胞的分化生成,加重了局部骨溶解,骨保護素(OPG)可與RANKL競爭性結(jié)合RANK,但不激活破骨細胞生成,從而起到骨保護的作用,成為目前破骨細胞研究中應用較多的靶蛋白。在假體-骨界面的炎癥修復過程中,肉芽組織大量形成并纖維化,使假體-骨界面之間形成一層偽膜,骨丟失與炎性偽膜的形成進一步加重了假體的松動,產(chǎn)生更多的磨損顆粒,使無菌炎癥和骨溶解加重形成惡性循環(huán)。本研究早期已

21、經(jīng)充分認識到在無菌性假體松動發(fā)生發(fā)展過程中,炎癥和骨溶解既相互區(qū)別又相互聯(lián)系的病理過程。通過體外實驗證明了應有IL-1受體阻斷劑和OPG聯(lián)合基因抑制炎癥和破骨細胞生成的有效性,為探討在體內(nèi)復雜內(nèi)環(huán)境下的聯(lián)合抗炎和抗骨溶解的效果,進行了在小鼠無菌性假體松動模型上對IL-1受體阻斷劑和OPG聯(lián)合基因治療的應用研究。目的1.建立適于長期研究無菌性假體松動的小鼠模型2.觀察無菌假體松動的病理變化3.在無菌性假體動物模型復雜的內(nèi)環(huán)境下應用IL-1

22、受體阻斷劑和骨保護素聯(lián)合基因治療,探討聯(lián)合抗炎和抗骨溶解的治療效果和可行性。材料與方法1.小鼠無菌性假體松動模型的創(chuàng)建及基因轉(zhuǎn)染24只10-12周BALB/c小鼠,實驗開始前小鼠隔離2周,腹小鼠麻醉后無菌在無菌條件下,沿右髕韌帶內(nèi)側(cè)做縱行切口,顯露脛骨平臺,刮除脛骨平臺軟骨,用直徑0.7mm的鉆頭從脛骨平臺中央垂直鉆入約5mm,準備植入鈦釘,在植入鈦釘之前向脛骨髓腔注入10μ L鈦顆粒懸浮液,術(shù)后立即進行X線拍片確定植入鈦釘位置正確。術(shù)

23、后每4周注射20μL鈦顆粒懸浮液至關(guān)節(jié)腔。術(shù)后第3周隨著無菌性假體松動發(fā)生隨機分為4組,分別為IL-1Ra治療組(6只),OPG治療組(6只),聯(lián)合基因治療組(6只),LacZ對照組(6只)。將50μL和25μL含有DFG-IL-IRa的無菌培養(yǎng)液分別注入IL-1Ra治療組。3天后將將50μL和125μ L含有AAC-OPG的無菌培養(yǎng)液分別注入OPG治療組和聯(lián)合基因治療組,同時將50u L含有AAV-LacZ的無菌培養(yǎng)液注入LacZ對照

24、組?；蛑委?周后處死小鼠,進行生物力學、組織學檢測和Micro-CT掃描2. Micro-CT掃描所有小鼠在術(shù)后1周麻醉后行Micro-CT掃描確認鈦釘位置良好,基因治療8周后再次性Micro-CT掃描,應用MicroCT自帶軟件進行脛骨近端鈦釘植入?yún)^(qū)進行三維重建,并計算獲取骨密度,骨容積/總?cè)莘e值。3.小鼠脛骨近端植入物生物力學檢測基因治療后8周處死小鼠,從假體關(guān)節(jié)處行膝關(guān)節(jié)離斷,去除假體周圍的軟組織顯露鈦釘帽,將假體及脛骨通過牙科

25、粉置于固定架上,假體釘帽置于固定架的夾持刀片中間,將固定架連接BOSE電子力學檢測系統(tǒng)并進行牽拉,對輸出的數(shù)據(jù)進行分析處理。4.組織學檢測拔釘實驗后收集脛骨近端的組織。應用福爾馬林緩沖液固定,12%EDTA脫鈣,石蠟包埋。蘇木精.伊紅(HE)染色后在光學顯微鏡下觀察新生骨或者骨質(zhì)破壞,并使用Image-Pro軟件測量假體和脛骨之間偽膜的厚度。5.統(tǒng)計學分析應用SPSS軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗或方差分析及多重比較。p<；0.05表示

26、具有顯著性差異。所有數(shù)值均用平均值±標準差表示。結(jié)果1. Micro-CT掃描基因治療8周后采用Scanco Micro-CT系統(tǒng)對所有小鼠進行骨掃描,三維重建顯示假體周圍骨溶解在聯(lián)合基因治療組明顯減少。通過對骨密度和骨容積/總?cè)莘e比值的統(tǒng)計,治療組相對于LacZ對照組均顯示明顯的治療效果。2.聯(lián)合基因治療組對脛骨近端植入物機械力學檢測因為假體周圍骨溶解的發(fā)生會導致假體生物力學穩(wěn)定性變差,因此基因治療8周后,應用拔釘實驗檢測脛骨近端植入

27、鈦釘?shù)姆€(wěn)定性。其中拔釘力線波峰代表鈦釘從脛骨中被拔出一瞬間的力。雖然OPG治療組數(shù)據(jù)波動較大,但仍顯示良好的穩(wěn)定性。相對于LacZ對照組,雙基因治療組顯示明顯的統(tǒng)計學差異。而IL-1Ra治療組相對于LacZ對照組,雖有不同但并未顯示統(tǒng)計學差異。(P=0.21)3.聯(lián)合基因治療組對骨重建的影響.脛骨近端切片HE組織染色,AAV-LacZ對照組可以觀察到假體骨界面的偽膜明顯較厚,而各治療組的假膜組織較薄,具有統(tǒng)計學意義(p<；0.05)