大鼠腎移植慢性排斥模型中外周血清間α胰蛋白酶抑制劑水平的意義探討.pdf

1、背景與目的：
　　 隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，在器官移植領(lǐng)域，組織配型技術(shù)取得跨越式的發(fā)展及新型免疫抑制劑在臨床中的應(yīng)用，腎移植術(shù)已成為臨床治療終末期腎病的主要方法，且人/腎存活率得到逐年升高，術(shù)后早期急性排斥反應(yīng)發(fā)生率明顯下降，移植腎短期存活率得到顯著提高，但移植腎長(zhǎng)期存活仍未得到明顯改善，這其中包含免疫因素和非免疫因素的作用，其中在免疫因素中慢性排斥反應(yīng)是其影響移植腎長(zhǎng)期存活率的主要因素，慢性排斥反應(yīng)仍然是一個(gè)長(zhǎng)期困擾移植界的

2、難題，供腎與受者達(dá)到完全耐受仍然是一個(gè)理想的目標(biāo)。到目前為止，移植腎病理活檢仍是目前能明確診斷慢性排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)，但鑒于其為有創(chuàng)操作，有導(dǎo)致不同并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)由于移植腎活檢標(biāo)本存在誤差，或缺乏程序性腎活檢的資料，供腎移植前存在組織學(xué)損傷和CsA或FK506腎毒性與慢性排斥難以區(qū)別，使慢性排斥反應(yīng)的診斷更復(fù)雜，診斷需要3-5天的時(shí)間。因此探討一種敏感特異的非侵襲性檢查方法和客觀指標(biāo)，對(duì)于診斷和預(yù)測(cè)慢性排斥反應(yīng)及其轉(zhuǎn)歸，及早干預(yù)病情的

3、發(fā)展，制定個(gè)體化免疫抑制方案均具有重要意義。
　　 間α胰蛋白酶抑制劑，inter-alpha-trypsin inhibitors(簡(jiǎn)寫成ITI)，是一系列蛋白水解酶抑制劑的統(tǒng)稱，血漿中含量較高，ITI在炎癥、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移等免疫活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。在膿毒癥、壞死性結(jié)腸炎等患者血漿中ITI的含量較正常人明顯下降，且下降幅度與病死率相關(guān)。而移植腎慢性排斥反應(yīng)無(wú)論是從組織形態(tài)學(xué)還是細(xì)胞因子角度分析，均存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因

4、子的釋放，在慢性排斥反應(yīng)中免疫應(yīng)答占據(jù)非常重要的位置，大量文獻(xiàn)證實(shí)ITI可以用于預(yù)測(cè)體內(nèi)免疫活動(dòng)強(qiáng)弱的功能，臨床或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，已成為膿毒癥、潰瘍性結(jié)腸炎、腫瘤等疾病的一個(gè)重要的預(yù)測(cè)及預(yù)后的指標(biāo)，也有大量事實(shí)證明其用于治療疾病上，鑒于ITI能預(yù)測(cè)體內(nèi)免疫反應(yīng)強(qiáng)弱的特性，我們通過(guò)檢測(cè)慢性排斥反應(yīng)大鼠血漿中ITI的水平，與正常腎移植組大鼠相比較，來(lái)初步探討ITI在大鼠慢性排斥反應(yīng)中所起的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)的目的就是通過(guò)觀察間α胰蛋白

5、酶抑制劑（inter-alpha-trypsin inhibitors，以下簡(jiǎn)稱ITI）在腎移植術(shù)后慢性排斥反應(yīng)及正常腎移植大鼠外周血?jiǎng)討B(tài)表達(dá)情況，并與移植腎病理檢查相比照，就ITI對(duì)移植腎慢性排斥反應(yīng)是否有預(yù)測(cè)作用展開初步探討和研究。
　　 方法：
　　 1、SD-Wistar大鼠腎移植模型的建立
　　 進(jìn)行一定時(shí)間的預(yù)實(shí)驗(yàn)，以熟悉顯微外科技術(shù)及能建立穩(wěn)定的腎移植模型，正式實(shí)驗(yàn)階段分別選用SD大鼠和Wistar

6、大鼠作為供體和受體，采用顯微外科手術(shù)技術(shù)行SD-Wistar左腎原位腎移植術(shù)。麻醉后分離供體左腎動(dòng)脈、靜脈、部分腹主動(dòng)脈及輸尿管，切取供腎前用4℃乳酸林格氏液(含肝素25U/ml)通過(guò)腹主動(dòng)脈原位灌注供腎至呈均勻土黃色，腎靜脈流出液清亮，切取供腎并置于4℃乳酸林格氏液無(wú)菌保存。再離斷受體左腎動(dòng)脈、靜脈及輸尿管后切除左腎，供、受體左腎動(dòng)脈、腎靜脈及輸尿管分別行端端吻合。受體右腎不切除,完整保留作為每個(gè)移植腎樣本的內(nèi)參照。慢性排斥反應(yīng)組受體

7、于術(shù)前3天起，即給予腹腔注射環(huán)孢素A微乳化劑2mg/kg，每日1次，以抑制急性排斥反應(yīng)，而正常腎移植組則給予環(huán)孢素A微乳化劑腹腔注射5mg/kg，每日1次。手術(shù)后當(dāng)天一次性肌注青霉素50mg/kg預(yù)防感染。并隨機(jī)選取兩組大鼠（各10只）在術(shù)后當(dāng)天取血標(biāo)本檢測(cè)CsA濃度谷值。
　　 2、大鼠腎移植慢性捧斥反應(yīng)組織病理及Treg細(xì)胞檢測(cè)
　　 取SD大鼠作為供者，Wistar大鼠作為受體，行SD-Wistar大鼠左腎原位移植

8、。保留受體自身右腎作為每一個(gè)移植腎的內(nèi)對(duì)照。所有受體均于術(shù)后當(dāng)天一次性肌肉青霉素50mg/kg預(yù)防感染。受者60只，存活57只（此數(shù)量包含術(shù)前大鼠，非實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)死亡的大鼠均依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求再補(bǔ)充至60只），取腎移植存活受體以及術(shù)前大鼠共60只進(jìn)行隨機(jī)實(shí)驗(yàn)分組，分成正常腎移植組（對(duì)照組，n=30）、慢性排斥反應(yīng)組（實(shí)驗(yàn)組，n=30）。實(shí)驗(yàn)組從術(shù)前3天起給予環(huán)孢素A(2mg/kg.d，腹腔注射)治療，以抑制急性排斥反應(yīng)，對(duì)照組從術(shù)前3天起給予環(huán)孢

9、素A(5mg/kg.d，腹腔注射)治療。移植前供者左腎及受者移植后第4周起陸續(xù)獲取移植腎，并取相應(yīng)的右腎作為內(nèi)參照，用10％中性福爾馬林固定，制作石蠟切片，行HE、PASM、Masson染色，行大體觀察及組織病理學(xué)檢測(cè)。
　　 根據(jù)組織病理學(xué)變化，取移植腎病理學(xué)變化最顯著的階段預(yù)先留取的血標(biāo)本，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)慢性排斥反應(yīng)與Treg細(xì)胞的關(guān)系作初步的探討。
　　 3、I

10、TI的檢測(cè)及初步探討其在大鼠腎移植慢性捧斥反應(yīng)中的意義
　　 分別取兩組大鼠術(shù)前、術(shù)后4、6、8、10、12周的血標(biāo)本（各5只），離心收集血漿標(biāo)本，制備出血漿蛋白，依次進(jìn)行下列步驟:分離膠和積層膠，制膠板;蛋白變性:準(zhǔn)備蛋白樣本，加入等體積的2×上樣Buffer稀釋，置于沸水中煮10min;加樣:每孔加入20-40μl樣品;電泳:置于電泳槽中電泳45min，恒定電流90mA;取出膠板，用切割刀修好膠;將膠置于轉(zhuǎn)膜液中浸泡;按順序

11、放好下列物質(zhì):黑面→海綿→濾紙→膠→NC膜→濾紙（用吸管趕去氣泡）→海綿;置于轉(zhuǎn)膜槽中，黑面對(duì)黑面，加上冰塊，加入轉(zhuǎn)膜液;裝好電極，于恒定電壓100V下，90min;麗春紅染膜;用TBST洗去麗春紅;封閉:加入5％脫脂奶粉+TBST，常溫?fù)u床搖1h;回收封閉液，加入一抗;置于4℃搖床搖過(guò)夜;回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次;加入二抗，常溫?fù)u床搖1h;回收二抗，TBST洗膜，10min，共3次;將膜置于發(fā)光液中浸泡約1min;將

12、膜鋪于曝光盒中，于暗室中曝光，洗膠片。
　　 結(jié)果：
　　 1、慢性排斥組術(shù)后第1天CsA濃度為101.17±12.17ng/ml;正常腎移植組術(shù)后第1天CsA濃度為171.33±18.49ng/ml(F=2.164，P=0.159)。預(yù)實(shí)驗(yàn)階段共用80只大鼠，其中SD、Wistar大鼠分別為40只，預(yù)實(shí)驗(yàn)階段重點(diǎn)是熟悉顯微技術(shù)操作及掌握并能穩(wěn)定制作大鼠腎移植模型，在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段，腎移植大鼠至少觀察12周，記錄大鼠存活狀況

13、以及各種術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生情況，經(jīng)過(guò)2個(gè)多月的顯微技能及模型制作的訓(xùn)練，即進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)階段，為便于分組及考慮到術(shù)后大鼠可能因某些不可預(yù)測(cè)因素致死的原因，適當(dāng)擴(kuò)大樣本量（即補(bǔ)充非實(shí)驗(yàn)處理因素所致死亡的大鼠），正式實(shí)驗(yàn)大鼠共60對(duì)，其中SD、Wistar大鼠分別為60只，記錄大鼠存活狀況以及各種術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生情況，（其中死亡大鼠指非按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃處死的大鼠）。在正式實(shí)驗(yàn)階段，供腎熱缺血時(shí)間6S～12S，冷缺血時(shí)間50min～80min，供體手術(shù)1～

14、1.5h，受體腎移植手術(shù)時(shí)間1.5～2h。
　　 2、正常腎移植組:肉眼所見(jiàn)移植腎大小適中，外觀飽滿，質(zhì)韌，腎表面鮮紅，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)移植腎大小、形態(tài)、質(zhì)地均無(wú)明顯的差別，組織病理學(xué)除見(jiàn)紅細(xì)胞浸潤(rùn)外未見(jiàn)其他明顯改變。
　　 移植腎慢性排斥組:移植腎逐漸呈現(xiàn)慢性排斥反應(yīng)改變，至術(shù)后第12周移植腎仍存活，體積較右腎明顯縮小，色澤較蒼白。光鏡下病變進(jìn)一步加重，除出現(xiàn)彌漫漿細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)外，腎小球基底膜增厚，廣泛的腎

15、小球硬化、萎縮以及間質(zhì)纖維化、炎癥，腎小管萎縮，小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，管腔狹窄甚至完全閉塞，呈典型的慢性排斥病理改變，尤以小動(dòng)脈內(nèi)膜纖維樣增厚為其特征性組織學(xué)改變。陰性內(nèi)對(duì)照的右腎未出現(xiàn)任何組織學(xué)改變。
　　 3、大鼠腎移植術(shù)后第12周正常腎移植組與慢性排斥反應(yīng)組血漿中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=6.155，df=8，P=0.000);CD4+FoxP3+Treg細(xì)胞在兩組血漿淋巴細(xì)胞中的比例也有顯著差異(t

16、=4.153，df=8，P=0.003)，即正常腎移植組血漿中CD4+CD25+標(biāo)記的Treg細(xì)胞及CD4+FoxP3+標(biāo)記的Treg細(xì)胞均高于慢性排斥反應(yīng)組。
　　 4、正常腎移植組與慢性排斥反應(yīng)組血漿中ITI表達(dá)量不同(P=0.040)，術(shù)前兩組ITI表達(dá)量無(wú)明顯差異(F=2.486，P=0.154)，術(shù)后4、6、8、10、12周ITI表達(dá)量均有顯著差異，其中術(shù)后4周、6周正常腎移植組ITI表達(dá)量低于慢性排斥反應(yīng)組（F值分別

17、為7.942、19.562，P值分別為0.023、0.002），而從術(shù)后8周開始至術(shù)后12周，正常腎移植組ITI表達(dá)量均高于慢性排斥反應(yīng)組(F值分別為40.004、26.393、27.883，P值分別為0.000、0.001、0.001);不同時(shí)間點(diǎn)所檢測(cè)的血漿ITI表達(dá)量不同，慢性排斥反應(yīng)組血漿ITI隨移植術(shù)后時(shí)間推移表達(dá)量逐漸下降(P=0.000)，正常腎移植組術(shù)后4周、6周、8周、10周ITI表達(dá)量與術(shù)前、術(shù)后12周均有顯著差異，

18、即低于術(shù)前水平，高于術(shù)后12周水平（P值均為0.000）;慢性排斥反應(yīng)組術(shù)后4周與術(shù)后6周間無(wú)顯著差異(P=1.000)，術(shù)后8周與術(shù)后10周也無(wú)差異(P=1.000)，其他各兩組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;分組與時(shí)間存在著交互效應(yīng)(P=0.000)，提示術(shù)后12周慢性排斥反應(yīng)組血漿ITI表達(dá)量最低。
　　 結(jié)論：
　　 1、通過(guò)本實(shí)驗(yàn)中的處理方法我們可制作穩(wěn)定的大鼠腎移植慢性排斥反應(yīng)模型，且病理學(xué)提示，大鼠腎移植慢性排斥反應(yīng)在