人尿胰蛋白酶抑制劑對移植腎樹突狀細胞成熟的作用及其在腎移植排斥中的意義.pdf

1、器官移植已成為終末期臟器衰竭的最佳治療方案,但排斥反應嚴重威脅著移植器官的功能和存活,是器官移植成功的最大障礙。在當前供體器官嚴重短缺的情況下,如何有效抑制排斥反應,保證移植物長期有功能存活、改善受者生活質(zhì)量是器官移植領(lǐng)域亟待解決的問題。尋求更加高效、低毒、低感染、低致瘤危險性的特異性免疫抑制劑已成為當前移植免疫學界研究的重點。因此,我們有必要重新通過排斥反應發(fā)生機制去尋找干預的新靶點。
　　腎移植過程中移植腎經(jīng)歷缺血、缺氧導致移

2、植臟器的非特異性炎癥損傷,通過“危險信號”激活固有免疫,促使樹突狀細胞(dendriticcell,DC)等抗原提呈細胞(antigen-presentingcells,APC)成熟,不僅分泌大量促炎細胞因子以激活更多的樹突狀細胞成熟,吸引其他炎癥細胞浸潤,同時導致DC表型改變、抗原提呈能力增強,當血流再通后,以DC為主的供者成熟APC與受者T細胞接觸,通過直接識別模式激活受者T細胞,參與活化受者的適應性免疫系統(tǒng),介導排斥反應發(fā)生。AP

3、C的活化是整個過程的核心,而目前的免疫抑制劑的作用主要是在針對排斥反應的效應性T細胞增殖階段的干預,沒有對抗原提呈細胞介導的T細胞活化階段進行處理,因此我們嘗試在此階段進行干預。
　　DC是目前所知的機體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞、適應性免疫的啟動者,是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能直接激活初始型T細胞的APC。DC在攝取抗原或接受炎癥因子刺激后活化成熟,高表達MHCII、共刺激分子CD80、CD86以及細胞間粘附分子,因而抗原提呈、免疫活化功能

4、大大加強;其表面高表達趨化固子受體CCR6和CCR7,并分泌趨化因子、IL-12、TNF-α等促炎細胞因子,介導中性粒細胞及淋巴細胞浸潤,加重組織損傷。
　　蛋白酶抑制劑烏司他丁(UrinaryTrypsinInhibitor,UTI)具有很廣的抑酶譜,能抑制胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、磷脂酶A、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶、纖溶酶等多種絲氨酸水解酶活性。此外,還能抑制心肌抑制因子的產(chǎn)生,改善微循環(huán)、穩(wěn)定溶酶體膜,抑制溶酶體酶的釋放、清除氧

5、自由基、抑制炎癥介質(zhì)的釋放等功能。臨床上用于嚴重燒傷、菌血癥、治療急性胰腺炎、多器官功能衰竭。
　　UTI不僅能夠抑制多種蛋白酶的活性,減輕組織損傷,減少“危險信號”的釋放,而且前期大量研究發(fā)現(xiàn)UTI可以抑制IL-12、TNF-α等促炎細胞因子的釋放。上述兩方面卻又是誘導DC成熟不可或缺的因素,因此,我們推測UTI能夠抑制DC成熟。本實驗采用UTI處理DC,體外研究UTI對LPS介導腎臟DC成熟的抑制作用,并通過小鼠腎臟移植模型的

6、體內(nèi)研究進一步證實UTI對移植腎內(nèi)DC的抑制作用并探討其在減輕移植腎排斥反應作用的意義。
　　第一章:烏司他丁抑制LPS介導小鼠腎臟固有樹突狀細胞成熟
　　目的:探討UTI對LPS介導小鼠rDC成熟的抑制作用。
　　方法:取C57BL/6J小鼠腎臟制備單細胞懸液,使用MACS(MagneticCellSorting)磁珠分選CD11c+的rDC,流式細胞儀鑒定rDC純度。LPS刺激24小時促使rDC成熟,給予不同濃度(

7、0~200U/mL)UTI處理,ELISA檢測上清液中IL-12的分泌水平;100U/mL的UTI處理后流式細胞儀檢測rDC表面MHCII、CD80、CD86分子,以觀察UTI對rDC表型及功能的影響;檢測趨化因子受體7(chemokinereceptor7,CCR7)的表達,計數(shù)受巨噬細胞炎癥蛋白3β(Macrophageinflammatoryprotein3β,Mip-3β)趨化進入細胞培養(yǎng)小室下層的CD11c+細胞數(shù)目,分析UT

8、I對rDC趨化能力的影響。
　　結(jié)果:LPS刺激促使rDC成熟,高表達MHCII、CD80、CD86分子并分泌大量IL-12,而UTI能夠抑制LPS介導表型和功能成熟。經(jīng)UTI處理CCR7分子的表達以及受趨化的CD11c+細胞數(shù)目顯著降低,表明可以抑制LPS介導的趨化能力上調(diào)。
　　結(jié)論:UTI能夠抑制LPS介導的小鼠腎臟樹突狀細胞成熟和趨化能力上調(diào)。
　　第二章:小鼠腎臟移植模型的建立
　　目的:建立小鼠腎臟移

9、植模型,為后續(xù)體內(nèi)實驗提供支持。
　　方法:以C57BL/6(H-2b)小鼠建立同系腎臟移植模型,共30對。戊巴比妥鈉按50mg/kg進行腹腔注射麻醉。供體手術(shù):取腹部大十字切口入腹,將腸道移向右側(cè),充分顯露左腎。4根8-0線分別于腎血管水平上下分別結(jié)扎腹主動脈及下腔靜脈,經(jīng)腹主動脈灌注肝素鹽水至腎臟成土黃色,在腎靜脈與下腔靜脈連接處剪斷腎靜脈、腎動脈下方2mm傾斜剪斷腹主動脈,取出腎臟放入4°C冰箱。受體手術(shù):切除小鼠右腎,采用

10、供者腹主動脈瓣對受者腹主動脈、供者腎靜脈對受者下腔靜脈端側(cè)吻合。移植腎臟迅速變?yōu)榉奂t色。將移植腎輸尿管拉入受者膀胱,輸尿管固定于膀胱,關(guān)閉腹腔。4-7天后麻醉下摘除左腎,受者完全靠移植腎存活。
　　結(jié)果:供者手術(shù)時間28.1±3.2min,受者阻斷血流時間31.3±3.5min,受者整體手術(shù)時間58.5±8.5min。30例手術(shù)成功21例,成功率70.0％。失敗的原因:移植腎灌注不良,深靜脈血栓形成及受者不能耐受腎移植手術(shù)或二次手

11、術(shù)。
　　結(jié)論:我們成功建立小鼠腎臟移植模型,為后續(xù)實驗提供支持。
　　第三章:烏司他丁抑制移植腎樹突狀細胞成熟減輕移植腎排斥反應
　　目的:探討UTI減輕小鼠腎移植后排斥反應的作用及機制。
　　方法:以Balb/c(H-2d)為供者,C57BL/6(H-2b)為受者,制備小鼠腎移植模型。Sham組為空白組(Balb/c(H-2d)),不進行腎移植也不給予UTI預處理;T組只進行腎移植,不接受UTI預處理;UT組

12、受鼠進行腎移植并且接受UTI預處理。術(shù)后檢測各組受鼠的血清肌酐(Serumcreatinine,SCr)水平,觀察各組移植腎組織病理改變,分析UTI對腎功能及急性排斥反應的發(fā)生。移植后24h通過RT-PCR檢測IL-6、IL-10、IL-17及TNF-α的表達以觀察移植腎的免疫狀態(tài);流式細胞儀檢測DC表面MHCII、CD80、CD86分子,以觀察UTI對DC成熟的影響。
　　結(jié)果:術(shù)后,UT組與T組受鼠SCr水平有所升高,但UT組

13、始終保持在較低水平(P<0.001);與Sham組相比,T組受鼠的移植腎彌漫浸潤單個核細胞,而UT組移植腎單個核細胞浸潤情況較T組明顯減輕,腎小球及腎小管形態(tài)大致正常,表明UTI能夠減輕急性排斥反應,提高移植腎功能。移植后24h,UTI顯著抑制移植物內(nèi)IL-6、IL-17及TNF-α的mRNA表達并提高IL-10的表達(P<0.001);T組較Sham組移植腎內(nèi)DC表面高表達MHCII、CD80、CD86分子,而UT組MHCII、CD8