應用基因芯片篩選β淀粉樣蛋白誘導的阿爾茨海默病細胞模型差異表達基因.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一種進行性神經系統(tǒng)退變疾病，是老年人癡呆的主要原因，主要臨床表現(xiàn)為記憶力障礙、持續(xù)性智能衰退、判斷推理能力喪失、運動障礙等。隨著社會老齡化趨勢日漸加重，AD已經成為繼心臟病、癌癥、腦血管病之后人類死亡的第四大病因。AD的主要病理改變是老年斑、神經纖維纏結、區(qū)域性神經元喪失。β-淀粉樣蛋白(Aβ)是老年斑核心的主要成份，被認為在阿爾茨海默病形成中起重要作用。Aβ介導的AD發(fā)病機制

2、非常復雜，涉及到基因突變、氧化應激、細胞凋亡、信號轉導、免疫炎癥等多種生物學過程。 為了研究AD的發(fā)病機制，我們加入凝聚態(tài)的Aβ25-35誘導人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞系，模擬AD損傷，構建AD細胞模型。以MTT法測定SH-SY5Y細胞在不同濃度Aβ25-35處理下細胞生存率的變化，光鏡及電鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)學變化，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片斷化情況，流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化。根據(jù)凋亡率、生存率及細胞形態(tài)學變化等，

3、確定以10μ/LAβ25-35誘導SH-SY5Y細胞48小時，應用安捷倫人全基因組表達譜基因芯片(AgilentHuman1Boligomicroarray)篩選該模型與未經誘導的對照細胞間差異表達基因，分析差異基因的功能及與AD相關性。 目標：篩選Aβ誘導的SH-SY5Y細胞模型的差異表達基因，分析差異表達基因與AD發(fā)病機制的相關性，在基因水平研究阿爾茨海默病發(fā)病的分子機制。 方法： 1.構建阿爾茨海默病細胞模

4、型： (1)培養(yǎng)SH-SY5Y細胞(1640培養(yǎng)基，15％FBS，37℃，05％CO2)。 (2)加入Aβ25-35進行誘導，作用濃度分別為0.1、1、10、20μmol/L，MTT法檢測細胞生存率。 (3)1.5％凝膠電泳檢測凋亡細胞的片斷化DNA，并在光鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化。 (4)透射電子顯微鏡觀察細胞是否出現(xiàn)明顯凋亡特征。 (5)流式細胞儀檢測細胞凋亡率變化，Aβ25-35作用濃度分別

5、為O、1、5、10、20μmol/L. 2.篩選AD模型中差異表達基因并研究其與AD發(fā)病機制的相關性： (1)培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，當細胞密度達到80％時平均分為兩組，一組作為對照組不加Aβ25-35處理，另一組10μmol/LAβ25-35誘導，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。采用RNeasyMiniKit(QIAGEN公司)分別提取兩組的總RNA。 (2)應用Agilent2100Bioanalyzer分析總RNA質量。

6、 (3)RNA樣品的標記(線性擴增法進行熒光標記，對照組標記Cy3-dCTP，處理組標記Cy5-dCTP)、與AgilentHuman1B芯片的雜交及清洗均按芯片配套試劑盒的說明進行。 (4)用Agilent2565基因芯片掃描儀掃描，得到芯片雜交結果。 (5)分析基因芯片數(shù)據(jù)，以P-Value≤0.01作為差異表達的標準，以Cy5(rprocessedsignals)/Cy3(gprocessedsignals

7、)≥2作為表達上調的標準，Cy5/Cy3≤0.5作為表達下調的標準。 (6)差異表達基因在Panther數(shù)據(jù)庫(www.pantherdb.org)進行分類。 結果： 1.對照組及Aβ25-35濃度依次是0.1、1、10、20μmol/L的處理組經MTT法檢測，OD570分別是0.3167±0.0153、0.3100±0.0100、0.2433±0.0116、0.1933±0.0058、0.1467±0.0252

8、。其中0.1umol/L處理組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其他處理組有顯著差異(P＜0.01)。細胞存活率隨Aβ25-35濃度升高而降低。 2.對照組及Aβ25-35作用濃度為1.0、5.0、10.0、20.0μmol/L時的細胞凋亡率分別是7.4％、15.6％、23.5％、27.1％、32.4％。 3.通過電鏡、光鏡觀察到處理組細胞出現(xiàn)顯著凋亡特征。瓊脂糖凝膠電泳檢測到片斷化的DNA所形成的梯狀條帶。

9、 4.篩選出1201個差異表達基因，其中411表達上調，790個表達下調，其中16個與AD密切相關基因分別涉及細胞凋亡、氧化應激、信號轉導、細胞骨架形成等。 結論： Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞成功構建AD細胞模型。實驗證明Aβ25-35可以引起細胞生存率下降，誘導細胞凋亡。經過表達譜基因芯片分析該細胞模型中差異表達基因，發(fā)現(xiàn)這些基因與產生AD的生物學過程密切相關，主要涉及細胞信號轉導、DNA\RNA\蛋