PcrV被動及主動免疫在多重耐藥銅綠假單胞菌致肺損傷保護作用研究.pdf

1、第一部分:PcrV被動免疫在多重耐藥銅綠假單胞致細胞毒性的保護作用研究
　　目的:通過測定臨床分離的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢ secretion system，T3SS)表達情況，比較耐藥組和敏感組菌株T3SS表達有無差異，應用PcrV抗體，觀察PcrV被動免疫對多重耐藥銅綠假單胞菌致細胞毒性是否有保護作用。
　　方法:隨機分離保存臨床分離的銅綠假單胞菌株，

2、經(jīng)過隨機引物擴增DNA多態(tài)性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分析確認為非同一克隆菌株，用微量肉湯稀釋法測定菌株對臨床常用抗假單胞菌抗生素的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）將菌株分為多重耐藥組和敏感組。應用普通PCR和多重PCR擴增T3SS的pcrV基因和毒素基因(exoU，exoS，exoY,exoT)，比較T3SS的基因型在耐藥組和敏

3、感組之間有無差異。Real-time PCR測定pcrV的相對表達水平，Western blot測定ExoU和ExoS的表達，從而比較T3SS的表型在耐藥組和敏感組之間有無差異。應用BEAS-2B細胞株，銅綠假單胞菌感染后，測定培養(yǎng)基中的LDH濃度，比較應用PcrV抗體后，培養(yǎng)基中的LDH濃度有無變化，從而觀察PcrV被動免疫對多重耐藥銅綠假單胞菌致細胞毒性有無保護作用。
　　結(jié)果:共分離出53株非同一克隆的臨床菌株，包括25個多

4、重耐藥菌株和28株敏感菌株，pcrV, exoT，exoY幾乎在所有菌株中均為陽性，exoU陽性率在30％左右，exoS陽性率在70％左右，兩組之間無顯著性差異;Real-time PCR比較之間pcrV相對表達無明顯差異，Western blot比較兩組之間ExoU，ExoS無顯著性差異。銅綠假單胞菌感染后，培養(yǎng)基中LDH顯著升高，應用PcrV抗體后，LDH濃度有顯著下降，下降20％左右，統(tǒng)計學分析差異有顯著性（P＜0.05）。

5、>　　結(jié)論:銅綠假單胞菌的T3SS的表達相對穩(wěn)定，在耐藥組和敏感組之間無明顯差異，PcrV被動免疫后，細菌的毒力下降，對多重耐藥菌株致細胞毒性具有顯著保護作用，在銅綠假單胞菌日益顯著的耐藥問題上，T3SS可以作為一個新的治療靶點，有望解決日益嚴重的銅綠假單胞菌耐藥問題。
　　第二部分: PcrV被動及主動免疫在多重耐藥銅綠假單胞菌致肺損傷的保護作用
　　目的:選擇一株多重耐藥銅綠假單胞菌株，體外分泌ExoU蛋白，建立多重耐藥

6、銅綠假單胞菌感染的小鼠肺損傷模型，觀察PcrV被動及主動免疫對小鼠的生存與肺損傷是否具有保護作用。
　　方法:選擇第一部分中的R4菌株建立小鼠肺損傷模型，通過氣道內(nèi)滴入法（5×10^6 cfu菌株）制作小鼠肺損傷模型。實驗分組:被動免疫組，主動免疫組，抗生素治療組，對照組。在感染后前12小時，每小時記錄一次體溫，以后每24小時記錄一次體溫，觀察7天，觀察小鼠的生存率。另外，分別在感染后的6小時和12小時處死小鼠，檢測血液及肺組織細

7、菌計數(shù);檢測肺泡灌洗液(BALF)中細胞的分類計數(shù)和蛋白濃度;檢測濕干重比值(W/D)、髓過氧化物酶(MPO)活性;檢測MIP-2、TNF-α、IL-6等細胞因子含量;觀察肺組織病理。另外我們進一步檢測分離出細菌的最低抑菌濃度(MIC)和生物膜表達情況，觀察阻斷PcrV后是否會影響細菌的MIC和生物膜的表達情況。
　　結(jié)果:在R4感染后，對照組小鼠在7天內(nèi)死亡率為100％，應用頭孢他啶（500mg/kg q12h腹腔注射）后，小鼠

8、的生存時間得到一定的延長，但也均于7天內(nèi)死亡。應用PcrV抗體（與細菌預混后同時打入小鼠肺內(nèi)），小鼠的生存率得到顯著改善。另外PcrV被動免疫后，小鼠血中和肺內(nèi)的細菌計數(shù)較其他兩組有顯著降低，肺部炎癥顯著減輕，W/D降低，肺泡灌洗液中蛋白濃度降低，肺泡灌洗液中中性粒細胞計數(shù)增加，且小鼠肺MPO活性在早期有顯著增加，12小時后與其他兩組相近。與此同時，PcrV被動免疫后，小鼠血清內(nèi)MIP-2，IL-6，TNF-α水平降低，肺泡灌洗液中IL

9、-6水平與其他兩組相似，MIP-2降低，TNF-α早期升高，12小時后降低。PcrV主動免疫4周后，小鼠血清中PcrV抗體滴度在15-20μg/mL左右，此后感染R4，小鼠的生存率得到顯著改善。另外，阻斷PcrV后，細菌對頭孢他啶的MIC沒有變化，但是可以抑制細菌生物膜的表達。
　　結(jié)論:PcrV被動免疫后，多重耐藥銅綠假單胞菌感染小鼠的生存率得到顯著改善，同時小鼠的肺損傷得到顯著減輕。PcrV主動免疫四周后，小鼠體內(nèi)血清抗體滴度

10、達到高峰，多重耐藥菌株感染后小鼠的生存率得到顯著改善。PcrV被動及主動免疫在多重耐藥銅綠假單胞菌株感染中發(fā)揮保護作用。并且阻斷PcrV可以抑制細菌生物膜的形成，使細菌更易被清除。
　　第三部分:角質(zhì)細胞生長因子-2在銅綠假單胞菌致肺損傷的作用研究
　　目的:探討角質(zhì)細胞生長因子-2（keratinocyte growth factor-2，KGF-2）對銅綠假單胞菌致肺損傷的保護作用，及其對巨噬細胞吞噬功能的影響。

11、　　方法:健康雄性Balb/c小鼠25g左右，分成3組，分組如下:1）無預處理組:無預處理，氣道內(nèi)滴入PBS60μl作為對照;2）對照組(control，C):氣道內(nèi)滴入銅綠假單胞菌(PAO1，1×10^7 cfu);3)KGF-2預處理組:動物在感染前72小時氣道內(nèi)滴入KGF-25mg/kg之后在制作感染模型。在PAO1感染后，前12小時，每小時記錄一次體溫，以后每24小時記錄一次體溫，觀察7天，觀察小鼠的生存率。另外，分別在感染后的

12、6小時和12小時處死小鼠，取肺泡灌洗液，血漿，并留取肺組織。血液及肺組織細菌培養(yǎng)檢測;分類計數(shù)肺泡灌洗液(BALF)中的細胞，檢測BALF中的蛋白濃度。檢測MIP-2、TNF-α、IL-6等細胞因子含量;觀察肺組織病理。檢測KGF-2預處理對肺組織p38 MAPK/NF-κB信號通路活性的影響。體外培養(yǎng)小鼠巨噬細胞（RAW264.7）進一步探討KGF-2對巨噬細胞吞噬功能的影響。
　　結(jié)果:在PAO1感染后，對照組小鼠在7天內(nèi)死亡

13、率為90％左右，KGF-2預處理后，小鼠的生存率得到顯著改善。另外KGF-2預處理后，小鼠血中和肺內(nèi)的細菌計數(shù)較對照組有顯著降低，肺部炎癥顯著減輕，W/D降低，BALF中蛋白濃度降低，肺泡灌洗液中中性粒細胞計數(shù)增加。于此同時，KGF-2預處理后，小鼠血清內(nèi)MIP-2，IL-6，TNF-α水平降低，肺泡灌洗液中也有所下降。KGF-2預處理顯著抑制了p38 MAPK/NF-κB信號通路的活化。體外實驗發(fā)現(xiàn)，KGF-2增強巨噬細胞吞噬功能。<