肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(LCMR1)與細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究.pdf

1、目的:肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(lungcancermetastasisrelatedprotein1,LCMR1)的編碼基因是我們實(shí)驗(yàn)室采用差異顯示技術(shù)(DDRT-PCR)克隆到的新基因(GenBankID:AY148462)。目前,其生物學(xué)功能尚不十分清楚。我們?cè)谇捌谘芯恐?通過蛋白-蛋白相互作用方法找到LCMR1相互作用蛋白DEK。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步揭示LCMR1與DEK的結(jié)合區(qū)域,并借助相互作用蛋白DEK功能區(qū)提供的線索,開展LCMR1功

2、能研究,探討其在細(xì)胞凋亡中的作用及作用機(jī)制,為在基因水平預(yù)防和治療肺癌尋找新的分子靶點(diǎn),為抗癌藥物的研發(fā)和肺癌治療提供線索和分子基礎(chǔ)。
　　方法:(1)構(gòu)建DEK(N端)功能區(qū)質(zhì)粒及DEK(C端)功能區(qū)質(zhì)粒,使用TNT兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液體系,在體外快速轉(zhuǎn)錄翻譯DEK(N端)功能區(qū)蛋白及DEK(C端)功能區(qū)蛋白。(2)應(yīng)用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),以pGEX-5T質(zhì)粒及pGEX-5T-LCMR1質(zhì)粒為模板,誘導(dǎo)表達(dá)GST蛋白及GST-L

3、CMR1融合蛋白。(3)采用GST融合蛋白沉降(GSTPull-down)技術(shù),研究LCMR1與DEK(N端)功能區(qū)、DEK(C端)功能區(qū)的結(jié)合情況,并借助DEK功能區(qū)提供的線索,初步推測(cè)LCMR1功能。(4)采用小干擾RNA技術(shù)敲減LCMR1,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印跡(WesternBlot)方法,在mRNA水平及蛋白水平驗(yàn)證LCMR1下調(diào)效果。(5)采用流式細(xì)胞術(shù)及PI染色法,檢測(cè)LCMR1下調(diào)后95D細(xì)胞

4、系、A549細(xì)胞系及H1299細(xì)胞系中凋亡細(xì)胞數(shù)量的變化;采用WesternBlot方法,檢測(cè)LCMR1下調(diào)后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8及caspase-9表達(dá)量變化;采用分光光度法檢測(cè)LCMR1下調(diào)后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3,caspase-8及caspase-9活性變化;采用qRT-PCR及WesternBlot方法,檢測(cè)LCMR1下調(diào)后細(xì)胞Bax,Bid及Mcl-1mRNA水平和蛋白水平變化。

5、
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建DEK功能區(qū)質(zhì)粒,并在體外成功轉(zhuǎn)錄翻譯功能區(qū)蛋白。(2)成功原核誘導(dǎo)表達(dá)并純化GST蛋白及GST-LCMR1蛋白。(3)通過GSTpull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí),LCMR1與DEK(N端)功能區(qū)有相互作用,LCMR1與DEK(C端)功能區(qū)無(wú)相互作用。(4)從mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證了設(shè)計(jì)的LCMR1小干擾RNA對(duì)LCMR1有明顯的敲減效果。(5)LCMR1與細(xì)胞凋亡關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),LCMR1下調(diào)導(dǎo)致:①凋亡細(xì)

6、胞增加并出現(xiàn)明顯凋亡峰;②活化的Caspase-3蛋白表達(dá)增加、活性增強(qiáng)。(6)LCMR1的凋亡機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),LCMR1下調(diào)導(dǎo)致:①活化的Caspase-8蛋白及活化的Caspase-9蛋白表達(dá)增多、活性增強(qiáng);②肺腺癌A549(p53+/+)細(xì)胞凋亡增加,肺腺癌H1299(p53-/-)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯增加;③促凋亡因子Bax及Bid表達(dá)升高,抑凋亡因子Mcl-1表達(dá)下降。
　　結(jié)論:(1)LCMR1與DEK(N端)功能區(qū)有相互作用