嗜尸性蠅類的分子標(biāo)記種屬鑒別與法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究.pdf

1、第一部分、線粒體DNA中COI基因序列在常見嗜尸性蠅類種屬鑒別中的應(yīng)用
　　目的：利用線粒體DNA(mtDNA)細(xì)胞色素氧化酶輔酶Ⅰ(COI)中的498bp和841bp基因序列，對(duì)常見嗜尸性蠅類進(jìn)行種屬鑒別，解決依據(jù)形態(tài)學(xué)方法難以鑒別現(xiàn)場(chǎng)樣本種屬的難題，為法醫(yī)現(xiàn)場(chǎng)檢案提供幫助。
　　方法：收集不同地區(qū)的2科4屬6個(gè)種的嗜尸性蠅類樣本，經(jīng)專業(yè)人員對(duì)樣本進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)，分別提取樣本mtDNA，利用COI基因序列中的兩對(duì)引物進(jìn)行不

2、同序列PCR擴(kuò)增，以瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR膠回收試劑盒純化，ABI377測(cè)序儀測(cè)序，將所得序列以DNAMAN6.0分析軟件分別截取498bp和841bp長(zhǎng)度的序列，分別輸入GenBank進(jìn)行BLAST檢索同源相似性比對(duì)，以MEGA5.1軟件進(jìn)行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析不同地區(qū)及不同種屬的樣本鑒別效果。
　　結(jié)果：5個(gè)地區(qū)6種嗜尸性蠅類30個(gè)樣本，mtDNA的COI基因序列Ⅰ(498bp) BLAST種屬同源性正確比對(duì)

3、28個(gè)，正確比對(duì)率達(dá)到93.33％，種內(nèi)進(jìn)化分歧均數(shù)在0.1％～1.6％之間，種間進(jìn)化分歧均數(shù)在2.2％～11.2％之間，除絲光綠蠅與銅綠蠅2個(gè)近緣種屬難以區(qū)分外，其余4個(gè)種屬通過系統(tǒng)發(fā)育樹可明確區(qū)分。3個(gè)地區(qū)6種嗜尸性蠅類36個(gè)樣本，mtDNA的COI基因序列Ⅱ(841bp) BLAST種屬同源性正確比對(duì)35個(gè)，正確比對(duì)率達(dá)到97.22％，種內(nèi)進(jìn)化分歧均數(shù)在0.2％～1.5％之間，種間進(jìn)化分歧均數(shù)在2.7％～10.6％之間，6個(gè)種屬通

4、過系統(tǒng)發(fā)育樹均可明確區(qū)分。
　　結(jié)論：COI基因序列同源性比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的種屬鑒別方法，是嗜尸性蠅類形態(tài)學(xué)種屬檢驗(yàn)的重要補(bǔ)充手段，對(duì)嗜尸性蠅類樣本種屬的快速、準(zhǔn)確鑒定有重要作用。
　　第二部分、不同食物成分對(duì)大頭金蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響
　　目的：觀察不同臟器及不同脂肪含量的肌肉組織對(duì)大頭金蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為昆蟲學(xué)相關(guān)研究及死后間隔時(shí)間(Post mortem interval，PMI)的法醫(yī)學(xué)推斷提供理論依據(jù)。

5、r>　　方法：取豬的腦、心臟、肝臟及腎臟制作4種臟器培養(yǎng)基，同時(shí)取肌肉和皮下脂肪組織，按照脂肪含量0％，10％，30％，50％和80％的質(zhì)量比重，分別制作5種混合食物培養(yǎng)基;在25℃恒溫條件下，以不同培養(yǎng)基飼養(yǎng)大頭金蠅初孵幼蟲，幼蟲孵化16h開始每12h取樣測(cè)量幼蟲體長(zhǎng)和體重，化蛹后取樣測(cè)蛹長(zhǎng)及蛹重，每次取樣10只，同時(shí)觀察并記錄不同階段的樣本數(shù)量，計(jì)算發(fā)育歷期，羽化完畢后計(jì)算各組幼蟲及蛹的死亡率和成蟲性別比率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次統(tǒng)計(jì)各組之間

6、的差異。
　　結(jié)果：不同臟器組織對(duì)大頭金蠅幼蟲、蛹及成蟲的體長(zhǎng)、體重產(chǎn)生明顯影響（P＜0.01），與其他3組比較取食肝組織的幼蟲生長(zhǎng)緩慢（P＜0.01），達(dá)到最大體長(zhǎng)和體重的時(shí)間延遲36 h，其2齡、3齡幼蟲期及總發(fā)育歷期明顯大于其他3組(P＜0.01);食物脂肪含量對(duì)大頭金蠅幼蟲、蛹及成蟲的體長(zhǎng)、體重產(chǎn)生明顯影響（P＜0.01），高脂肪組織食物早期可促進(jìn)幼蟲生長(zhǎng)，孵化40 h后則抑制其生長(zhǎng)并使發(fā)育歷期縮短（P＜0.01），幼蟲及

7、蛹的死亡率增高(P＜0.01);不同組織源食物對(duì)成蟲的性別比率無明顯影響（P＞0.03）。
　　結(jié)論：食物成分的不同會(huì)對(duì)大頭金蠅個(gè)體大小、生長(zhǎng)發(fā)育歷期及死亡率可產(chǎn)生明顯影響，在昆蟲學(xué)相關(guān)研究及法醫(yī)學(xué)檢案的PMI推斷時(shí)應(yīng)引起足夠重視。
　　第三部分、固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定大頭金蠅樣本內(nèi)的氯氮平
　　目的：建立嗜尸性蠅類樣本內(nèi)氯氮平（clozapine，CLP）的有效定量檢測(cè)方法，為此類藥物中毒死亡案件的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)分

8、析提供幫助。
　　方法：采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(SPME-GC-MS)的方法，以100μm聚二甲基硅氧烷萃取頭萃取，洛沙平為內(nèi)標(biāo)，氣相色譜質(zhì)譜選擇離子方式檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量檢測(cè)大頭金蠅幼蟲及蛹樣本內(nèi)的CLP;分析不同發(fā)育時(shí)期，取食含有不同濃度CLP的肌肉組織的樣本內(nèi)CLP含量，比較食物與樣本體內(nèi)CLP濃度間的關(guān)系。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)建立的SPME-GC-MS法能準(zhǔn)確定量檢測(cè)昆蟲樣本內(nèi)的氯氮平，CLP的檢出限為