腺病毒介導(dǎo)CⅡTA突變體基因轉(zhuǎn)移防治實驗性自身免疫性甲狀腺炎的研究.pdf

1、實驗性自身免疫性甲狀腺炎(experimentalautoimmunethyroiditis，EAT)由于與人類橋本甲狀腺炎具有相似的病理特征與疾病進(jìn)程，因此常作為研究橋本甲狀腺炎發(fā)病機(jī)理的動物模型。EAT是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的以甲狀腺上皮細(xì)胞變性、壞死、纖維化并伴有大量單個核細(xì)胞浸潤為病理特征的免疫性炎癥。在甲狀腺組織中，MHC-Ⅱ類分子異常表達(dá)，CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量局部浸潤、致炎因子分泌增加，導(dǎo)致抗甲狀腺球蛋白自身反應(yīng)性T細(xì)胞的

2、激活是造成正常甲狀腺損傷的主要原因。因此，有可能通過靶向性抑制CⅡTA的表達(dá)，下調(diào)MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)及其對自身抗原肽的遞呈，達(dá)到對EAT進(jìn)行防治的目的。 有鑒于此，本研究旨在：(1)通過構(gòu)建CⅡTA突變體的重組腺病毒，觀察其對MHC-Ⅱ類分子組成性和誘導(dǎo)性表達(dá)的抑制作用；(2)研究CⅡTA突變體基因轉(zhuǎn)移在預(yù)防和治療EAT中的效果及其可能機(jī)制。 本研究設(shè)計了一種小鼠Ⅳ型CⅡTA的突變體，造成其N-端第109-226位氨

3、基酸的缺失突變。用常規(guī)分子生物學(xué)方法和重疊延伸PCR法(OE-PCR)構(gòu)建了該突變體的兩種腺病毒表達(dá)載體(pAdEasy-1系統(tǒng))，即pAd-CMV-CⅡTAm和pAd-pⅣ-CⅡTAm；腺病毒載體經(jīng)HEK293細(xì)胞包裝產(chǎn)生含CⅡTA突變體的重組腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-CⅡTAm，用氯化銫密度梯度離心法獲得純化的高滴度腺病毒；采用多種方法對重組腺病毒進(jìn)行了定量檢測與活性評價；并將Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-

4、CⅡTAm分別感染SVEC細(xì)胞與J774細(xì)胞，觀察其對誘導(dǎo)性與組成性MHC-Ⅱ類分子表達(dá)的抑制；用純化的豬甲狀腺球蛋白免疫CBA/J小鼠，誘導(dǎo)實驗性自身免疫性甲狀腺炎模型的產(chǎn)生，并分別于免疫后0～2天與14～16天經(jīng)尾靜脈注射重組腺病毒，觀察CⅡTA突變體對實驗性自身免疫性甲狀腺炎的預(yù)防與治療效果及其機(jī)制。 本研究包括三個部分： 第一部分CⅡTA突變體重組腺病毒載體的構(gòu)建、擴(kuò)增、純化和滴度測定本部分內(nèi)容中有關(guān)重組腺病毒的

5、構(gòu)建和包裝的實驗內(nèi)容由本實驗室2005屆碩士研究生管政完成。采用重疊延伸PCR法(OE-PCR)造成CⅡTA基因N端第325-678位堿基的缺失突變，克隆到pIRES上，得到重組質(zhì)粒pIRES-CⅡTAm。構(gòu)建Ad-CMV-CⅡTAm時，將pIRES-CⅡTAm克隆到pAdTrack穿梭質(zhì)粒上，經(jīng)PmeI線性化后轉(zhuǎn)入BJAdEasy-1感受態(tài)菌中進(jìn)行同源重組，獲得pAd-CMV-CⅡTAm重組腺病毒骨架質(zhì)粒。構(gòu)建Ad-pⅣ-CⅡTAm時

6、，先構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-pⅣ并將CⅡTAm克隆到其中，得到pShuttle-CⅡTAm-pⅣ，經(jīng)PmeI線性化后轉(zhuǎn)入BJAdEasy-1感受態(tài)菌中進(jìn)行同源重組，獲得pAd-pⅣ-CⅡTAm重組腺病毒骨架質(zhì)粒。將pAd-CMV-CⅡTAm和pAd-pⅣ-CⅡTAm分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，當(dāng)出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時收獲培養(yǎng)上清及細(xì)胞反復(fù)凍融后的細(xì)胞裂解液上清，獲得完整的病毒顆粒。 本部分構(gòu)建的重組腺病毒載體為進(jìn)行顯性失活C

7、ⅡTA突變體抑制CⅡTA基因表達(dá)，定量下調(diào)MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)，以及防治自身免疫性疾病動物模型打下了基礎(chǔ)。 通過半數(shù)組織細(xì)胞病變法(TCID50)、流式細(xì)胞術(shù)和實時熒光定量PCR法測定了經(jīng)CsCl雙密度梯度超速離心純化的重組腺病毒的感染活性與實際病毒顆粒數(shù)。兩組方法之間的差距平均不超過102倍，且兩組方法內(nèi)之間的結(jié)果具有明顯的可比性，表明了經(jīng)純化的重組腺病毒具有較穩(wěn)定的性質(zhì)。由于測定感染活性的方法往往缺乏客觀的判斷標(biāo)準(zhǔn)，且耗時

8、耗力，較易引起誤差，而測定病毒實際顆粒數(shù)的方法又不能反映病毒的感染活性，因此我們推薦在測定病毒滴度時運(yùn)用多種方法聯(lián)合評價。由于我們純化的病毒活性比較高，為了保持后續(xù)實驗的重復(fù)性，我們使用了實際病毒顆粒數(shù)作為劑量標(biāo)準(zhǔn)。 第二部分CⅡTA突變體重組腺病毒的表達(dá)調(diào)控和體外功能研究 本部分首先使用小鼠IFN-γ分別對小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞株SVEC和小鼠巨噬細(xì)胞株J774進(jìn)行刺激，觀察IFN-γ對MHC-Ⅱ類分子表達(dá)的作用。發(fā)現(xiàn)小鼠I

9、FN-γ能夠誘導(dǎo)SVEC細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ類分子(IAk)，且隨劑量的增大而使其表達(dá)升高；J774細(xì)胞組成性表達(dá)MHCⅡ類分子(IAd)，但小鼠IFN-γ對J774細(xì)胞MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)有明顯增強(qiáng)作用。分別用重組腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-CⅡTAm轉(zhuǎn)染SVEC和J774細(xì)胞，同時以空載病毒Ad-GFP作為對照，觀察它們對誘導(dǎo)性與組成性MHC-Ⅱ類分子表達(dá)的抑制作用，同時觀察野生型CⅡTAmRNA(CⅡTAwt)和突

10、變型CⅡTAmRNA(CⅡTAm)表達(dá)的差異。研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體介導(dǎo)Ad-CMV-CⅡTA和Ad-pⅣ-CⅡTAm轉(zhuǎn)染J774細(xì)胞后，表達(dá)MHC-Ⅱ類分子的細(xì)胞陽性率明顯下降；Ad-CMV-CⅡTA和Ad-pⅣ-CⅡTAm感染SVEC細(xì)胞后，對IFN-γ刺激作用的敏感性明顯降低，表達(dá)MHC-Ⅱ類分子的細(xì)胞陽性率顯著降低。上述結(jié)果證實了重組腺病毒Ad-CMV-CⅡTA和Ad-pⅣ-CⅡTAm能夠有效抑制組成性與誘導(dǎo)性MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)。

11、實時定量RT-PCR同時檢測這些細(xì)胞中CⅡTAwt、CⅡTAm的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CⅡTAwt的表達(dá)受ⅡFN-γ的明顯誘導(dǎo)或增強(qiáng)，且腺病毒轉(zhuǎn)染對CⅡTAwtmRNA表達(dá)水平影響不大。這說明，CⅡTA突變體抑制MHCⅡ類分子的表達(dá)，并不是通過減少CⅡTAwt的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的。我們認(rèn)為，可能是野生型CⅡTA與MHCⅡ啟動子區(qū)上的穩(wěn)定小體的結(jié)合受到突變型CⅡTA蛋白的強(qiáng)烈競爭，從而降低了MHCⅡ類分子的轉(zhuǎn)錄活性。Ad-CMV-CⅡTAm感染

12、或轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，CⅡTAmmRNA有較高水平的表達(dá)，而Ad-pⅣ-CⅡTAm感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，CⅡTAmmRNA表達(dá)水平很低，需IFN-γ刺激才能有高水平表達(dá)。這證實Ad-pⅣ-CⅡTAm中CⅡTAmmRNA的表達(dá)是IFN-γ依賴性的。 第三部分腺病毒介導(dǎo)CⅡTA突變體基因轉(zhuǎn)移防治實驗性自身免疫性甲狀腺炎的研究 選擇6周齡的CBA/J小鼠，分別于0天和第7天皮下注射100μg純化的豬甲狀腺球蛋白及CFA/IFA，制備實驗性

13、自身免疫性甲狀腺炎動物模型。分別于初次免疫后0～2天與14～16天經(jīng)小鼠尾靜脈注射重組腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-CⅡTAm(單次劑量為5×109Vp/只)作為預(yù)防實驗組與治療實驗組，并同時以空載病毒Ad-GFP作為其各自的對照組，再設(shè)立單純免疫組與正常組對照。小鼠于初次免疫后第28天眼球取血后，脫頸處死，解剖獲取甲狀腺與脾臟。甲狀腺病理檢查判斷甲狀腺病損程度，測定小鼠血漿抗甲狀腺球蛋白抗體的滴度與總IgG的量判斷小鼠的

14、體液免疫功能，測定小鼠脾臟單個核細(xì)胞對ConA和甲狀腺球蛋白刺激的增殖能力及細(xì)胞因子的分泌能力反映小鼠細(xì)胞免疫功能，免疫組化測定小鼠甲狀腺組織中浸潤單個核細(xì)胞與甲狀腺組織中MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)測定脾及外周血的淋巴細(xì)胞亞群與MHC-Ⅱ類分子、ICOS的表達(dá)。 結(jié)果顯示：在預(yù)防性實驗組，以Ad-CMV-CⅡTAm處理的小鼠甲狀腺病損程度明顯減輕，誘導(dǎo)表達(dá)的MHC-Ⅱ類分子明顯受抑，自身抗體與總IgG水平均明顯下降，脾單

15、個核細(xì)胞對甲狀腺球蛋白的刺激明顯受抑，外周血與脾臟中活化T細(xì)胞上的MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)及活化T細(xì)胞數(shù)均明顯減少，細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2降低。這表明早期使用重組腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm能夠有效防止自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)生。在治療性實驗組，以Ad-CMV-CⅡTAm處理的小鼠表現(xiàn)出甲狀腺病損程度減輕、脾單個核細(xì)胞對甲狀腺球蛋白刺激的應(yīng)答明顯受抑，自身抗體的滴度明顯下降，活化T細(xì)胞上的MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)量及活化T細(xì)胞數(shù)均明顯

16、減少，但甲狀腺濾泡細(xì)胞上仍有一定水平的MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)。這些結(jié)果表明發(fā)病后應(yīng)用Ad-CMV-CⅡTAm治療能夠明顯減輕甲狀腺炎的病損程度，對甲狀腺炎具有一定的治療效果。 以Ad-pⅣ-CⅡTAm代替Ad-CMV-CⅡTAm進(jìn)行預(yù)防或治療EAT，結(jié)果顯示Ad-pⅣ-CⅡTAm的效果接近Ad-CMV-CⅡTAm，能有效預(yù)防及治療EAT。這說明CⅡTAm基因在pⅣ啟動子調(diào)控下，在EAT病理發(fā)生過程能有效表達(dá)，并發(fā)揮抑制MHC-Ⅱ