順鉑誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡后超微弱發(fā)光與氧自由基水平的變化.pdf

1、宮頸癌仍是婦科中高發(fā)的惡性腫瘤，目前在臨床治療中，化療是一個(gè)基本而重要的抗腫瘤手段。然而在化療過(guò)程中仍會(huì)產(chǎn)生因化療藥物使用后出現(xiàn)藥物不敏感或多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR），造成治療失敗。近年來(lái)研究表明，大多數(shù)化療藥物都是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮其作用，可又如何評(píng)價(jià)其化療效果，臨床上至今仍缺乏客觀的檢測(cè)指標(biāo)，而超微弱發(fā)光為解決這一問(wèn)題提供了新的可能。任何有生命的物質(zhì)可以輻射出一種極其微弱的光子流，這種現(xiàn)象稱為

2、生物的超微弱發(fā)光現(xiàn)象（Ultraweak Photon Emission，UPE），亦被稱為生物系統(tǒng)超微弱光子輻射（Ultraweak Photn Emission From Bioluminescence）是普遍存在于有機(jī)體內(nèi)的一種自發(fā)的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。其發(fā)光強(qiáng)度非常弱，僅為10-104Photons/cm2·s，波長(zhǎng)范圍200～800nm，是生物體進(jìn)行新陳代謝過(guò)程中細(xì)胞自發(fā)的輻射極其微弱的光子流，它廣泛存在于動(dòng)物、植物以及單細(xì)胞生物之

3、中。大量研究表明，超微弱發(fā)光與生物體的許多重要生命過(guò)程，如氧化代謝、去毒作用、細(xì)胞分裂、光合作用和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等，尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。不同細(xì)胞或同種細(xì)胞的不同生理與病理狀態(tài)，其發(fā)光強(qiáng)度都存在著明顯的差別，而有關(guān)化療藥物的應(yīng)用對(duì)腫瘤細(xì)胞的超微弱發(fā)光的影響，目前研究甚少。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用化療藥物順鉑(cisplatin DDP)，在非毒性劑量下，來(lái)誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡后，研究其超微弱發(fā)光強(qiáng)度的變化以及細(xì)胞內(nèi)氧自由

4、基水平變化的特點(diǎn)，從而探討腫瘤化療與細(xì)胞超微弱發(fā)光之間的聯(lián)系及指導(dǎo)臨床實(shí)踐奠定基礎(chǔ)。
　　目的：探討DDP作用于人宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，并比較用藥前后細(xì)胞超微弱發(fā)光強(qiáng)度以及細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平的變化特點(diǎn)。
　　方法：
　　1．選擇化療藥物DDP作用于Hela細(xì)胞，采用MTT法有效的選擇DDP半抑制濃度IC50，來(lái)評(píng)價(jià)DDP對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒性；
　　2．分別用光鏡、HE染色、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化法和電鏡來(lái)

5、觀察Hela細(xì)胞凋亡前后的形態(tài)變化；
　　3．用IFFM-D型流動(dòng)式化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡前后，在不同條件下的超微弱發(fā)光強(qiáng)度的變化；
　　4．用化學(xué)比色法檢測(cè)凋亡前后Hela細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD以及GSH含量的變化。
　　結(jié)果：
　　1．DDP的細(xì)胞毒性效果評(píng)定：當(dāng)DDP濃度為3mg/L以下時(shí)，對(duì)Hela細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用（P<0.01），超過(guò)3mg/L以上時(shí)，其毒性呈劑量效應(yīng)（P<0.01）；隨著DDP

6、劑量增加，對(duì)細(xì)胞存活產(chǎn)生明顯影響。
　　2．DDP作用于Hela細(xì)胞凋亡前后的形態(tài)變化：
　?。?）光學(xué)顯微鏡觀察：經(jīng)3mg/LDDP分別作用12h，24h，48h，72h，96h后，對(duì)照組中Hela細(xì)胞體積較大，呈多邊形，折光性好；實(shí)驗(yàn)組經(jīng)DDP作用不同時(shí)間后逐漸出現(xiàn)脫壁和凋亡現(xiàn)象。
　?。?）掃描電鏡下：Hela細(xì)胞組細(xì)胞表面有豐富的微絨毛，細(xì)胞間隙清晰可見(jiàn)，線粒體嵴完整；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)，凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，細(xì)

7、胞之間出現(xiàn)間隔，細(xì)胞膜較多的球狀突起。透射電鏡下：Hela細(xì)胞核大而形狀不規(guī)則，胞漿內(nèi)含有豐富的游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，實(shí)驗(yàn)組凋亡和變性死亡的細(xì)胞增多，可見(jiàn)大小不等的凋亡細(xì)胞和凋亡小體及細(xì)胞腫脹、溶解壞死。
　　（3）流式細(xì)胞儀：經(jīng)DDP作用后Hela的G2期細(xì)胞顯著增多，而S期細(xì)胞明顯減少（P<0.01）；且細(xì)胞凋亡率隨DDP作用時(shí)間的不同明顯增高，分別在24h，48h，72h為(11.4±5.8,21.8±7.9,32

8、.5±11.6)％，（P<0.05）；
　　（4）免疫組化結(jié)果顯示：對(duì)照組Hela細(xì)胞膜上p27表達(dá)為陰性，實(shí)驗(yàn)組Hela細(xì)胞膜上p27為陽(yáng)性，且高表達(dá)約為80％；
　　3．Hela細(xì)胞經(jīng)3mg/LDDP作用后，在不同條件下細(xì)胞超微弱發(fā)光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，但明顯低于對(duì)照組（P<0.01）；
　　4．經(jīng)DDP作用后Hela細(xì)胞內(nèi)SOD的活性顯著降低（P<0.05），MDA的含量則有所升高（P<0.01），GSH的含量也明顯降

9、低（P<0.05）；
　　結(jié)論：
　　1．DDP能有效抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)示DDP的非毒性劑量為3mg/L；
　　2．DDP作用后的Hela細(xì)胞超微弱發(fā)光強(qiáng)度值顯著降低。其原因可能與細(xì)胞增殖速度減慢，使蛋白質(zhì)氧化，DNA鏈斷裂，細(xì)胞內(nèi)氧化代謝減弱等因素有關(guān)；
　　3．DDP作用后的Hela細(xì)胞內(nèi)氧自由基的含量升高，抗氧化劑的活性明顯減低，使過(guò)多的氧自由基積聚，影響細(xì)胞的功能狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡，可能